1、目的:
　　防治圍術(shù)期心肌缺血/再灌注損傷、為心血管疾病患者提供完善的心肌保護一直是醫(yī)學上力求攻克的難題。越來越多的研究表明,泛醇-細胞色素C還原酶核心蛋白1(Ubiquinol-cytochrome creductase core protein1,UQCRC1)表達上調(diào)可能參與了心肌保護效應(yīng),但其作用及其機制仍不清楚。本研究通過構(gòu)建UQCRC1腺病毒真核表達載體,并建立UQCRC1過表達的H9c2細胞模型,探討UQCRC1過表

2、達在心肌保護中的作用及其機制,為開發(fā)特異性的心肌保護藥物提供新的靶點。
　　方法:
　　通過構(gòu)建UQCRC1腺病毒真核表達載體,并在H9c2細胞過表達UQCRC1基因和蛋白,采用氧糖剝奪損傷(Oxygen-glucose deprivation,OGD)和過氧化氫損傷等方法來探討UQCRC1過表達在心肌保護中的作用,以及采用外源性Zn2+和Zn2+特異性螯合劑N,N,N',N'-四-(2-吡啶基甲基)乙二胺(N,N,N′,N

3、′-tetrakis-(2-pyridylmethyl) Ethylenediamine, TPEN)、信號通路特異性阻斷劑如磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)特異性阻斷劑 LY294002和胞外信號調(diào)節(jié)激酶(Extracellular-signal-regulated kinase,ERK)特異性阻斷劑PD98059等,通過熒光探針標記、免疫熒光染色以及Western blot等技

4、術(shù),檢測細胞存活率、細胞凋亡率、線粒體膜電位、線粒體內(nèi)游離鋅離子濃度及相關(guān)信號蛋白和凋亡相關(guān)蛋白表達,以研究UQCRC1過表達在心肌保護中作用及其相關(guān)的信號通路。
　　結(jié)果:
　　1、成功構(gòu)建UQCRC1腺病毒真核表達載體,并在H9c2心肌細胞成功建立UQCRC1過表達模型。
　　2、UQCRC1過表達在H9c2心肌細胞OGD損傷和過氧化損傷中起保護作用。OGD損傷后,UQCRC1過表達能上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達

5、和下調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達、減少Active Caspase3的表達、增加心肌細胞存活率;UQCRC1過表達還能降低過氧化損傷后心肌細胞凋亡率、維持細胞線粒體的膜電位。
　　3、UQCRC1通過與Zn2+結(jié)合產(chǎn)生保護效應(yīng),外源性 Zn2+能增強UQCRC1的心肌保護作用,螯合掉細胞內(nèi)Zn2+則完全消除UQCRC1過表達的保護作用;UQCRC1表達上調(diào)能使細胞線粒體內(nèi)游離Zn2+濃度降低,而下調(diào)UQCRC1表達則能釋放較多的Zn2

6、+使線粒體內(nèi)游離 Zn2+濃度顯著增高。結(jié)果提示,Zn2+是 UQCRC1發(fā)揮心肌保護作用的必不可少的輔因子,而UQCRC1則可能是Zn2+在線粒體內(nèi)的重要結(jié)合位點。
　　4、UQCRC1通過激活PI3K/Akt/GSK-3β信號通路上調(diào)Bcl-2表達、下調(diào)Bax表達和抑制OGD損傷后Caspase3凋亡信號通路的激活以及增加心肌細胞的存活率、維持線粒體膜電位和減少細胞凋亡,從而產(chǎn)生心肌保護效應(yīng)。
　　(1)抑制PI3K活性

7、能完全消除UQCRC1過表達對OGD損傷或過氧化損傷后心肌細胞存活、細胞凋亡和線粒體膜電位的保護作用。
　　(2)UQCRC1過表達能增加OGD損傷后H9c2心肌細胞PI3K下游信號分子蛋白激酶B(Protein kinase B,PKB即Akt)的磷酸化水平而激活A(yù)kt、增加糖原合酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)的磷酸化水平而使GSK-3β活性降低;抑制PI3K活性則完全消除O

8、GD損傷后UQCRC1過表達對PI3K下游信號分子Akt和GSK-3β的磷酸化。
　　(3)UQCRC1過表達可調(diào)節(jié)H9c2心肌細胞OGD損傷后凋亡相關(guān)蛋白的表達而減少細胞凋亡損傷。UQCRC1過表達能減少OGD損傷后Active Caspase3的表達,從而抑制心肌細胞Caspase3凋亡信號通路的激活;UQCRC1過表達還可增加OGD損傷后Bcl-2蛋白的表達,減少Bax蛋白的表達,使Bax/Bcl-2的比值降低,從而增加心肌

9、細胞的抗凋亡損傷作用;抑制PI3K活性則能完全消除UQCRC1過表達對OGD損傷后Active Caspase3的影響,同時也完全消除了對Bax和Bcl-2表達的影響。
　　5、UQCRC1部分通過激活ERK/GSK-3β信號通路來產(chǎn)生心肌保護效應(yīng)。
　　(1)抑制ERK活性后,部分消除OGD損傷和過氧化損傷后UQCRC1過表達對心肌細胞存活、細胞凋亡和線粒體膜電位的保護作用。
　　(2)抑制ERK活性能部分消除UQC

10、RC1過表達對GSK-3β的磷酸化作用。
　　(3)抑制ERK活性能部分消除UQCRC1過表達減少OGD損傷后Active Caspase3表達的作用,同時也部分消除了對Bax的下調(diào)表達和對Bcl-2的上調(diào)表達作用。
　　結(jié)論:
　　1、UQCRC1過表達在H9c2心肌細胞缺血/再灌注損傷和過氧化損傷中起保護作用。
　　2、Zn2+是UQCRC1過表達產(chǎn)生心肌保護效應(yīng)的必不可少的輔助因子,同時, UQCRC1也是