1、目的：
　　類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種慢性、炎癥性自身免疫性疾病，其主要的病理特征是滑膜炎癥，滑膜組織的增生，炎性細(xì)胞的浸潤，血管翳的形成，進而侵蝕軟骨和骨組織，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形和功能喪失。RA在世界范圍內(nèi)的患病率約為0.5％-1％，我國的患病率約為0.3％-0.6％，是一種致殘率較高的疾病，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，因此該疾病給患者和社會都造成了沉重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。
　　RA的病因及發(fā)病

2、機制尚未完全明確，成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-likesynoviocytes，F(xiàn)LS)作為RA的主要效應(yīng)細(xì)胞，一直是RA研究的熱點。近年來研究表明，RA FLS增生活躍，具有腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)性，主要表現(xiàn)為異常過度的增殖，非錨定依賴性生長，抵制凋亡刺激，導(dǎo)致凋亡不足，侵襲性增高，產(chǎn)生促炎因子以及促進軟骨破壞的蛋白激酶和趨化因子等，從而形成錯綜復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，使滑膜炎癥持續(xù)存在，并促進滑膜新生血管的形成。新近的研究結(jié)果顯示

3、:活化的RA FLS可以遷移很長一段距離，并能在一定程度上將RA關(guān)節(jié)炎癥播散至未受累及的其他關(guān)節(jié)。因此，調(diào)節(jié)RAFLS遷移和侵襲等生物學(xué)活性，識別新的生物學(xué)信號分子作為RA治療的新靶點顯得尤其重要。
　　鞘脂代謝產(chǎn)物是細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡的動態(tài)平衡中，具有舉足輕重的地位。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1，SPHK1)是細(xì)胞內(nèi)鞘脂代謝的關(guān)健酶，主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核周圍，在特定的

4、激動劑作用下轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上并磷酸化生成1磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-1phosphate，S1P)。S1P作為SPHK1的下游代謝產(chǎn)物，能調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、遷移、接觸和黏附、存活以及血管的形成，調(diào)控多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)活性。最近越來越多的研究證實，SPHK1/S1P參與RA的發(fā)生與發(fā)展，并有望成為RA治療的新靶標(biāo)。
　　RA發(fā)病過程中涉及多種信號通路，3-磷酸肌醇激酶/蛋白激酶B(phosphoinositide3-

5、kinase/protein kinase B，PI3K/AKT)信號通路作為細(xì)胞內(nèi)主要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，廣泛存在于滑膜組織，調(diào)控RA FLS的生長、增殖、生存和凋亡。有研究證實，SPHK1的下游代謝產(chǎn)物S1P能夠通過PI3K/AKT信號途徑調(diào)節(jié)肌纖維細(xì)胞的增殖和遷移。對于體外培養(yǎng)的人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，SPHK1能激活A(yù)KT抵制細(xì)胞凋亡，而且SPHK1能提高AKT活化和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-

6、α)誘導(dǎo)的細(xì)胞周期蛋白D的表達(dá)，從而促進細(xì)胞的存活和增殖。而且，越來越多的證據(jù)表明PI3K/AKT信號通路調(diào)控多種細(xì)胞的遷移和侵襲，由此，我們推測SPHK1可能通過PI3K/AKT信號通路進而調(diào)控RA FLS遷移和侵襲的能力。
　　金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)家族是一類依賴金屬鋅離子的蛋白水解酶家族，能有效地降解細(xì)胞外基質(zhì)，在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移過程中均起著重要作用。MMPs在多種腫瘤

7、細(xì)胞的侵襲過程中發(fā)揮作用，而且涉及細(xì)胞的遷移以及血管的新生。RA FLS分泌MMPs，降解細(xì)胞外基質(zhì)，破壞骨質(zhì)，參與血管翳的形成，加速關(guān)節(jié)血管的形成。既往研究證實，PI3K/AKT信號通路及下游分子MMP-2和MMP-9能參與多種腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲，而且，過度表達(dá)的MMP-2和MMP-9能促進RA FLS的侵襲，但其具體信號機制尚不明確。因此，抑制MMP-2和MMP-9的表達(dá)可能減少RA FLS的遷移和侵襲能力，識別調(diào)控MMP-2和M

8、MP-9表達(dá)的因子可能是RA治療的新靶點。
　　小分子干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。此技術(shù)是一種抑制特定基因產(chǎn)物的有效方法，具有特異性高、沉默效率高、穩(wěn)定性好等優(yōu)點。siRNA技術(shù)已廣泛應(yīng)用到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，如基因功能測定、惡性腫瘤、病毒性肝炎和艾滋病治療

9、等。
　　本研究擬通過檢測及分析RA患者滑膜組織中SPHK1的表達(dá)，并通過siRNA技術(shù)靶向沉默SPHK1基因，觀察SPHK1對RA FLS增殖、遷移和侵襲能力的影響;以特異性信號阻斷劑LY294002作為干擾手段，探討SPHK1調(diào)節(jié)RA FLS遷移和侵襲的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，探討SPHK1在RA發(fā)病中的可能作用機制。
　　實驗方法：
　　1.通過手術(shù)獲取的RA和OA患者滑膜組織，一部分用4％多聚甲醛固定后行免疫組化染色檢測

10、SPHK1的表達(dá);一部分置于-80℃冰箱中凍存行Western blot檢測SPHK1的蛋白水平。體外培養(yǎng)成纖維樣滑膜細(xì)胞(RAFLS)，免疫組化染色進行鑒定并檢測SPHK1在RA FLS中的表達(dá)及定位。
　　2.Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染SPHK1 siRNA至RA FLS，實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time polymerase chain reaction，real-time PCR)篩選出有效的SPHK1

11、 siRNA片段。使RA FLS SPHK1基因表達(dá)沉默后，WST-1法檢測SPHK1對RAFLS增殖能力的影響。采用Transwell小室系統(tǒng)檢測SPHK1對RA FLS遷移和侵襲能力的影響。Western blot法檢測SPHK1蛋白水平，探討SPHK1是否調(diào)控RAFLS的生物學(xué)活性。
　　3.對體外培養(yǎng)的RAFLS加入特異性信號阻斷劑LY294002，Transwell小室系統(tǒng)檢測SPHK1對RAFLS遷移和侵襲能力的影響。

12、Western blot法檢測3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide3-kinase，PI3K)、蛋白激酶B(Protein kinase B，AKT)和磷酸化蛋白激酶B(phospho-Akt，p-AKT)蛋白水平，ELISA檢測細(xì)胞上清液中基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)和基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)的分泌水平

13、，探討SPHK1調(diào)節(jié)RAFLS遷移和侵襲的可能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。
　　結(jié)果：
　　1.RA患者滑膜組織SPHK1蛋白水平高于OA患者，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。體外培養(yǎng)的RAFLS經(jīng)光鏡和免疫組化法鑒定符合RAFLS特征。RAFLS中可見SPHK1表達(dá)，主要位于細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核周圍。
　　2.篩選出1679序列是針對人SPHK1的特異性siRNA，抑制率約為72.2％。沉默RAFLS中的SPHK1基因表達(dá)，SPHK

14、1蛋白水平下降，RAFLS的增殖、遷移和侵襲能力明顯受抑制，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.在RAFLS中SPHK1基因表達(dá)沉默后，我們發(fā)現(xiàn)PI3K、p-AKT蛋白水平減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，AKT蛋白水平無明顯改變，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。細(xì)胞上清液中MMP-2和MMP-9分泌降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。特異性信號阻斷劑LY294002能進一步減少SPHK1 siRNA所致的PI

15、3K、p-AKT蛋白表達(dá)及MMP-2和MMP-9的分泌，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1.RA患者滑膜組織SPHK1表達(dá)和蛋白水平增高，RA FLS中SPHK1表達(dá)增多，提示SPHK1可能參與了RA的發(fā)生發(fā)展。
　　2.RA FLS中SPHK1基因表達(dá)沉默后，抑制了RA FLS的增殖、遷移和侵襲能力。這種抑制作用可能與SPHK1蛋白水平減少有關(guān)。說明SPHK1可能是參與RA FLS增殖、遷移和侵襲