1、研究背景：
　　 鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma NPC)是我國南方地區(qū)高發(fā)的一種惡性腫瘤(發(fā)病率每年在10-150/1001000)，也是頭頸部常見的惡性腫瘤之一，治療上以放療或輔助誘導(dǎo)化療加放療為主，但放化療導(dǎo)致的局部及全身后遺癥嚴重影響了患者的生存質(zhì)量。并且，由于鼻咽癌的發(fā)病部位較為隱蔽，首診時多數(shù)患者已經(jīng)伴有淋巴結(jié)侵襲或和遠處轉(zhuǎn)移，因此，同步放化療成為局部晚期鼻咽癌患者治療的標(biāo)準方式。但有報道化

2、療耐藥占到惡性腫瘤約75％左右，成為鼻咽癌治療失敗，出現(xiàn)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、影響總體生存率的因素之一。目前，腫瘤多藥耐藥的機制還不清楚，如何逆轉(zhuǎn)耐藥提高治療效果成為鼻咽癌治療領(lǐng)域亟待解決的問題。
　　 腫瘤細胞的多藥耐藥性(multidrug resistance MDR)是指細胞對結(jié)構(gòu)和功能均不同的化療藥物產(chǎn)生的耐藥性，分為原發(fā)性和獲得性耐藥，后者較為常見。研究MDR的分子機制，對于提高鼻咽癌患者的生存率，減少復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移極其重要。一些

3、研究表明，端粒長度/端粒酶活性參與腫瘤MDR。我們課題組曾較為系統(tǒng)探討了端粒酶在鼻咽癌發(fā)病中的作用，發(fā)現(xiàn)端粒酶在鼻咽癌細胞及鼻咽癌CD133+干細胞中高表達，靶向降低端粒酶活性可以明顯抑制鼻咽癌細胞增殖及遷移。
　　 PinX1基因是近年在人和酵母菌細胞中發(fā)現(xiàn)的一個能與端粒/端粒酶相互作用的保守核仁蛋白，是端粒酶結(jié)合蛋白pin2/TRF1相互作用的一種結(jié)合蛋白，并且是唯一能直接與端粒酶結(jié)合的一種端粒結(jié)合蛋白，高表達PinX1的C

4、-端片段能顯著抑制細胞端粒酶活性，縮短端粒并抑制端粒酶陽性腫瘤細胞在體內(nèi)外生長，被有些學(xué)者認為是一種內(nèi)源性的端粒酶抑制劑，我們的前期研究也證實了PinX1能降低鼻咽癌細胞株的端粒酶活性，并促進該腫瘤細胞凋亡的產(chǎn)生。在一系列前期研究工作的基礎(chǔ)上，本研究擬觀察PinX1基因在鼻咽癌細胞化療增敏、逆轉(zhuǎn)化療耐藥中的作用，并進一步探討端粒酶、抗凋亡因子Bcl2及耐藥相關(guān)基因LRP在這一過程中的調(diào)控作用。
　　 研究目的：
　　 觀

5、察PinX1基因聯(lián)合順鉑對人鼻咽癌細胞生物學(xué)特性的影響，為基因聯(lián)合化療減低鼻咽癌化療抵抗提供理論依據(jù);探討端粒酶活性改變、抗凋亡基因Bcl-2及肺耐藥相關(guān)基因LRP對在上述過程的調(diào)節(jié)作用。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 1、重組慢病毒的構(gòu)建及鑒定
　　 將含PinX1的質(zhì)粒連接到慢病毒穿梭載體上，并經(jīng)雙酶切及測序鑒定確認，與另外兩種輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞，收集并濃縮重組病毒液，用濃度梯度法計算病毒滴度。

6、>　　 2、慢病毒感染鼻咽癌細胞、檢測感染前后PinX1的變化
　　 分別將慢病毒Lenti-PinX1和對照組慢病毒Lenti-Crtl感染過的鼻咽癌細胞命名為Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Crtl-5-8F細胞。并用熒光定量PCR檢測Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Crtl-5-8F和5-8F細胞中基因mRNA的表達，Westernblotting檢測PinX1蛋白的表達。
　　 3、

7、PinX1聯(lián)合順鉑對鼻咽癌細胞株生物學(xué)特性的影響
　　 1)用MTT法檢測不同處理組鼻咽癌細胞株的體外增殖能力
　　 對感染前后的鼻咽癌細胞5-8F和Lenti-PinX1-5-8F加入不同濃度順鉑處理后，酶標(biāo)儀測570nm處的吸光度即OD(570)值，每組設(shè)置5個復(fù)孔，取各復(fù)孔的平均值為各組結(jié)果。然后，計算生長抑制率，繪制生長抑制曲線，并據(jù)Q=E(A+B)/(EA+EB-EA*EB)計算PinX1與化療藥間的相互作用。

8、
　　 2) Hoechst33258染色對細胞的凋亡進行形態(tài)學(xué)觀察
　　 分別將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F以1×104/ml、500ul/孔接種到24孔板中.培養(yǎng)12h待細胞貼壁后，PBS洗細胞兩次，按實驗分組分別加入500ul全培稀釋的順鉑（16ug/ml）或完全培養(yǎng)基，繼續(xù)置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，4％多聚甲醛室溫固定細胞、1ug/ml的Hoechst33258染色，熒光顯微鏡下觀

9、察細胞形態(tài)變化。
　　 3)流式細胞儀檢測細胞周期
　　 收集對數(shù)生長期的Lenti-PinX1-5-8F和5-8F細胞，PBS洗滌、重懸，調(diào)整細胞濃度為1×106/ml，取1ml細胞懸液;1000rpm離心5min，棄上清;加入4℃預(yù)冷70％乙醇固定，經(jīng)PBS洗滌，加入100ul RnaseA37℃水浴30min;避光加入400ulPI染液4℃避光染色至少30 min;流式細胞儀上機檢測
　　 4) Trans

10、well小室檢測不同處理后鼻咽癌細胞的遷移能力
　　 將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F細胞接種到24孔板中，待細胞貼壁后分別給予全培稀釋的16ug/ml順鉑或全培繼續(xù)培養(yǎng)48小時，PBS洗滌細胞，胰酶消化后用不含血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛确N到上室內(nèi)，下室事先加入含20％胎牛血清的全培，37℃，5％CO2培養(yǎng)12小時，將小室置于4％多聚甲醛中固定20min，用棉簽擦去上室內(nèi)細胞，置于1‰結(jié)晶紫染色20-30min

11、，清水漂洗至少3次，吹干后用高倍顯微鏡(400×)隨機取上、下、左、右、中5個視野對細胞進行計數(shù)。
　　 5)劃痕實驗檢測鼻咽癌細胞的愈合能力
　　 將Lenti-PinX1-5-8F和5-8F接種到6孔板中，待細胞融合度達80％左右時，用200ul的槍頭在每孔中垂直劃“+”，并用PBS洗滌脫落細胞，分別加入無血清培養(yǎng)基稀釋的16ug/ml的順鉑或無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，分別在劃痕后0h、12h、24h、36h時觀察并拍照

12、，計算愈合率。
　　 4、過表達PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘毎卸肆Ｃ富钚?、Bcl-2和LRP表達的影響
　　 收集對數(shù)生長期的Lenti-PinX1-5-8F、Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細胞，采用Stretch PCR法檢測端粒酶相對活性，熒光定量PCR和Western blotting檢測Bcl-2和LRP表達情況，進一步了解PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘毎熢雒舻姆肿訖C制。
　　 5、統(tǒng)計學(xué)分析

13、>　　 采用SPSS13.0軟件處理包進行數(shù)據(jù)處理分析，參數(shù)比較先進行方差齊性檢測，若方差不齊，用基于方差不齊的近似F檢驗的Welch法。熒光定量PCR、Western Blotting、端粒酶活性檢測、小室實驗及流式測細胞周期均采用One-WayANOVA方差分析，方差齊的用LSD法進行多重比較，方差不齊的用Dunnett's T3法進行多重比較。細胞增殖實驗(MTT)和劃痕實驗均采用析因設(shè)計的方差分析。P＜0.05具有統(tǒng)計學(xué)意義，

14、P＜0.01具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 研究結(jié)果：
　　 1、重組慢病毒的構(gòu)建與鑒定
　　 分別用雙酶切及測序鑒定了重組載體的正確，成功獲取了病毒液，病毒滴度為1.3×107IU/ml。
　　 2、重組慢病毒對鼻咽癌細胞的感染及感染前后PinX1的表達變化
　　 慢病毒Lenti-PinX1和對照組慢病毒Lenti-Crtl感染鼻咽癌細胞48h時均可觀察到綠色熒光表達，對照組慢病毒Lenti-Cr

15、tl感染組熒光相對較強、較多，隨著時間延長，熒光量均增多、增強，當(dāng)感染后96h時熒光表達最多，未感染的細胞始終看不到熒光表達;qRT-PCR和Western blotting均顯示Lenti-PinX1-5-8F細胞中PinX1基因較Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細胞中表達增多。
　　 3、PinX1基因聯(lián)合順鉑對鼻咽癌細胞株生物學(xué)特性的影響
　　 MTT檢測顯示PinX1、順鉑單用均能不同程度的抑制鼻咽癌細胞

16、的增殖，但兩者聯(lián)合的增殖抑制能力最為明顯，當(dāng)PinX1與8-32ug/ml濃度的順鉑聯(lián)合時均出現(xiàn)協(xié)同作用，尤其在16ug/ml濃度時，協(xié)同作用最大?？梢?，PinX1可以增加鼻咽癌細胞對順鉑的敏感性;Hoechst33258染色進一步從形態(tài)學(xué)方面說明PinX1和16ug/ml的順鉑聯(lián)合應(yīng)用時核固縮、核碎裂等凋亡細胞更為明顯;流式細胞儀對細胞周期進行檢測，顯示PinX1與16ug/ml的順鉑聯(lián)合能更明顯的將細胞周期阻止在G0/G1期，減少細

17、胞的分裂增殖能力;小室試驗和劃痕試驗也證實PinX1與順鉑的聯(lián)合能顯著抑制細胞的遷移和愈合能力。
　　 4、PinX1基因?qū)Ρ茄拾┘毎卸肆Ｃ富钚?、抗凋亡基因Bcl-2和肺耐藥相關(guān)基因LRP的影響
　　 Stretch PCR對端粒酶相對活性進行檢測，發(fā)現(xiàn)Lenti-PinX1-5-8F細胞中端粒酶相對活性明顯低于Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細胞;qRT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，

18、Lenti-PinX1-5-8F中Bcl-2、LRP低于Lenti-Ctrl-5-8F和5-8F細胞。
　　 結(jié)論：
　　 1、PinX1基因聯(lián)合順鉑能增加對鼻咽癌5-8F細胞的化療敏感性，尤其是PinX1基因與16ug/ml的順鉑聯(lián)合應(yīng)用時協(xié)同作用更強，說明聯(lián)合應(yīng)用在增強化療療效的同時，還可以減少順鉑的用藥劑量，這對降低化療藥的全身毒副作用有意義。
　　 2、PinX1基因增加順鉑化療敏感性、逆轉(zhuǎn)耐藥作用有可能