1、慢性腎衰竭在我國近年來的發(fā)病率有顯著增高的趨勢(shì)，是嚴(yán)重影響人類健康的疾病之一。目前已有大量的臨床及實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明腎間質(zhì)纖維化在慢性腎臟疾病進(jìn)展中具有重要作用，故有效地抑制腎間質(zhì)纖維化可減緩腎臟疾病的進(jìn)展。腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟疾病進(jìn)展至慢性腎衰竭的共同病理改變，由多種因素誘導(dǎo)而成，細(xì)胞增殖及表型轉(zhuǎn)化均參與這一過程并發(fā)揮著重要的作用。腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化(tubularepithelial-myofibroblasttransdiff

2、erentiation，TEMT)的概念由Strutz于1994年提出，并已被證實(shí)為腎間質(zhì)纖維化的核心病理改變，其標(biāo)志物為α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)。TEMT的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜，與多種因素相關(guān)，單一途徑阻斷難以獲得理想效果，故尋找具有多種生理效應(yīng)、多途徑抑制TEMT的藥物對(duì)減緩其進(jìn)展有重要作用。腎上腺髓質(zhì)素(adrenomedullin，ADM)是1993年發(fā)現(xiàn)的一種生物活性多肽，已證實(shí)該物質(zhì)分布于體內(nèi)多個(gè)重要臟器及組織中，腎臟是

3、ADM表達(dá)及分布較多的器官之一。ADM具有拮抗轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(Transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)、血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ，AngⅡ)、抗氧化、抗炎等多種生理作用，可以拮抗多種臟器纖維化。TEMT進(jìn)程中，最為重要的發(fā)生機(jī)制是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β的誘導(dǎo)作用，故推論ADM可通過調(diào)控TGF-β、抑制TEMT從而減輕腎臟損傷，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探索。ADM尚未用于臨床，中藥抑制腎間質(zhì)纖維化的

4、作用是否與其相關(guān)？前期實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)化瘀滌痰通絡(luò)中藥——腎絡(luò)通能通過抑制TGF-β1拮抗TEMT的進(jìn)展，是否通過調(diào)控ADM而發(fā)揮作用尚不明確。本實(shí)驗(yàn)研究采用ADM基因部分敲除小鼠(+/-)，以單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)方法復(fù)制腎間質(zhì)纖維化模型，以醛固酮受體阻斷劑依普利酮為對(duì)照藥物，觀察腎絡(luò)通對(duì)野生及ADM基因敲除小鼠腎組織中α-SMA、TGF-β1、Ⅲ型膠原(collagentypeⅢ，ColⅢ)及ADM表達(dá)的影響，探討化瘀滌痰通絡(luò)中藥抑

5、制TEMT拮抗腎間質(zhì)纖維化的作用機(jī)制及其與ADM的關(guān)系，為臨床提供治療思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 第一部分:化瘀滌痰通絡(luò)中藥對(duì)ADM基因敲除腎間質(zhì)纖維化小鼠腎功能及腎臟組織形態(tài)學(xué)的影響
　　 方法:野生及ADM基因敲除小鼠各20只均隨機(jī)分為四組，即野生小鼠分為假手術(shù)組(WT-Shamgroup)、模型組(WT-UUOgroup)、依普利酮組（WT-UUOEgroup）及中藥組（WT-UUOSgroup）四組;基因敲除小鼠同樣

6、分為假手術(shù)組（AMKO-Shamgroup）、模型組(AMKO-UUOgroup)、依普利酮組(AMKO-UUOEgroup)及中藥組(AMKO-UUOSgroup)四組。除假手術(shù)組游離左側(cè)輸尿管但不結(jié)扎外，其余各組均行左側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)。中藥組給予化瘀滌痰通絡(luò)中藥腎絡(luò)通27.6g/(kg.d)經(jīng)口灌服;依普利酮組給予依普利酮混勻于飼料中按100mg/(kg.d)劑量食入。假手術(shù)組及模型組經(jīng)口灌服與中藥湯劑等劑量的生理鹽水。觀察一般情況，

7、給藥10天。于實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，稱重，斷頭取血，分離血清，分別測(cè)定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)水平;摘取左側(cè)腎臟并稱重，計(jì)算各組腎重/體重比值，進(jìn)行腎臟組織HE、Masson染色，觀察組織病理學(xué)改變。
　　 數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(X)±s）表示，使用SPSS16.0forwindows統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，組間比較采用單因素方差分析。顯著性差異水平以0.05和0.01為標(biāo)準(zhǔn)。
　　 結(jié)果:
　　 1.實(shí)驗(yàn)小鼠腎重

8、/體重比值測(cè)定結(jié)果
　　 野生及基因敲除小鼠的模型組、依普利酮組及中藥組顯著高于相應(yīng)的假手術(shù)組（P均＜0.01），但各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。(見Table1-1)
　　 2.小鼠腎組織病理形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果
　　 HE染色顯示，野生及基因敲除小鼠中，假手術(shù)組未見明顯異常。模型組可見腎小管擴(kuò)張，腎小管上皮細(xì)胞水腫，部分壞死、脫落，炎性細(xì)胞在腎間質(zhì)區(qū)廣泛浸潤(rùn)。Masson染色顯示，野生及基因敲除小鼠中

9、，假手術(shù)組腎臟結(jié)構(gòu)未見明顯異常，小管基底膜完整，腎間質(zhì)可見少量膠原成分。模型組腎組織間質(zhì)膠原成分沉積顯著增多，并呈條帶狀或灶狀分布，且基因敲除小鼠重于野生小鼠。依普利酮組及中藥組間質(zhì)膠原成分較模型組明顯減少，其中基因敲除小鼠較野生小鼠損傷為重。
　　 3.腎功能檢測(cè)結(jié)果
　　 Scr及BUN測(cè)定結(jié)果顯示，野生及基因敲除中各組小鼠的Scr及BUN值雖有差異，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。
　　 第二部分:化瘀滌

10、痰通絡(luò)中藥對(duì)ADM基因敲除腎間質(zhì)纖維化小鼠α-SMA的影響
　　 方法:動(dòng)物分組、模型復(fù)制、給藥方法同第一部分，共10天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取腎臟，采用RT-PCR、Western-Blot、免疫組化法檢測(cè)各組小鼠腎臟α-SMAmRNA及蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第一部分。
　　 結(jié)果:
　　 1.腎組織α-SMAmRAN檢測(cè)結(jié)果采用RT-PCR測(cè)定α-SMAmRNA在腎組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示，野生及基因敲除中的假手術(shù)組

11、小鼠呈弱表達(dá)，模型組表達(dá)較相應(yīng)的假手術(shù)組顯著增強(qiáng)（P＜0.01;P＜0.01），且基因敲除模型組顯著高于野生小鼠模型組(P＜0.05)。依普利酮組及中藥組表達(dá)下調(diào)(P＜0.01;P＜0.01)。
　　 2.腎組織α-SMA蛋白檢測(cè)結(jié)果WesternBlot結(jié)果顯示，野生及基因敲除小鼠中的假手術(shù)組腎組織α-SMA蛋白表達(dá)較弱，模型組表達(dá)明顯增強(qiáng)，顯著高于相應(yīng)的假手術(shù)組(P＜0.01;P＜0.01)，且基因敲除模型組顯著高于野生小鼠

12、模型組(P＜0.05)。依普利酮組及中藥組表達(dá)明顯低于相應(yīng)的模型組(P＜0.01;P＜0.01)，中藥組與依普利酮組無明顯差異(P均＞0.05)。
　　 3.腎組織α-SMA免疫組化檢測(cè)光鏡下野生及基因敲除小鼠的假手術(shù)組僅在血管平滑肌細(xì)胞表達(dá)，腎小球、腎小管及間質(zhì)未見表達(dá);模型組中α-SMA表達(dá)明顯增多，多見于皮髓交界及皮質(zhì)區(qū)的小管間質(zhì)部分?；蚯贸∈竽Ｐ徒M表達(dá)尤其明顯。依普利酮組及中藥組α-SMA表達(dá)較模型組明顯減少。但基因

13、敲除小鼠表達(dá)較野生小鼠更為明顯。
　　 第三部分:化瘀滌痰通絡(luò)中藥對(duì)ADM基因敲除腎間質(zhì)纖維化小鼠TGF-β1、ColⅢ的影響
　　 方法:動(dòng)物分組、模型復(fù)制、給藥方法同第一部分，共10天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取腎臟，采用RT-PCR、Western-Blot、免疫組化法檢測(cè)各組小鼠腎臟TGF-β1、ColⅢmRNA及蛋白的表達(dá)，并用天狼猩紅染色法測(cè)定腎臟膠原組織表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第一部分。
　　 結(jié)果:
　　

14、1.腎組織TGF-β1、ColⅢmRNA檢測(cè)
　　 1.1TGF-β1mRNART-PCR測(cè)定結(jié)果顯示，野生及基因敲除中的假手術(shù)組小鼠呈弱表達(dá)，模型組顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型組表達(dá)更為明顯，顯著高于野生小鼠模型組(P＜0.05);依普利酮組及中藥組明顯低于模型組(P＜0.05;P＜0.05)。
　　 1.2ColⅢmRNART-PCR測(cè)定結(jié)果顯示，野生及基因敲除中小鼠的假手術(shù)組呈極弱表

15、達(dá)，模型組顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型組顯著高于野生小鼠模型組（P＜0.01）;依普利酮組及中藥組明顯低于相應(yīng)模型組小鼠(P＜0.01;P＜0.01)。野生及基因敲除小鼠之間比較，基因敲除小鼠中藥組及依普利酮組表達(dá)均明顯高于野生型同組小鼠(P＜0.05;P＜0.05)。
　　 2.腎組織中TGF-β1及ColⅢ蛋白檢測(cè)
　　 2.1TGF-β1WesternBlot測(cè)定野生及基因敲除小鼠假

16、手術(shù)組TGF-β1蛋白少量表達(dá)，模型組表達(dá)顯著高于假手術(shù)組(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型組表達(dá)顯著高于野生小鼠模型組(P＜0.01)。依普利酮組及中藥組表達(dá)明顯低于相應(yīng)模型組(P＜0.01;P＜0.01)。
　　 2.2ColⅢWesternBlot測(cè)定結(jié)果顯示，野生及基因敲除小鼠假手術(shù)組少量表達(dá)，模型組顯著高于相應(yīng)的假手術(shù)組(P＜0.01;P＜0.01)，基因敲除模型組顯著高于野生小鼠模型組(P＜0.01)。野生

17、及基因敲除小鼠依普利酮組及中藥組明顯低于相應(yīng)模型組(P＜0.05;P＜0.01)。野生及基因敲除兩型之間比較，基因敲除小鼠中藥組與依普利酮組均明顯高于野生型的同組小鼠（P＜0.05;P＜0.05）。
　　 3.腎組織TGF-β1及ColⅢ免疫組化檢測(cè)
　　 3.1TGF-β1免疫組化檢測(cè)野生及基因敲除小鼠的假手術(shù)組腎臟TGF-β1呈弱表達(dá)，可見于腎小球及腎小管上皮細(xì)胞;模型組TGF-β1表達(dá)明顯增強(qiáng)，其中基因敲除小鼠尤其

18、顯著;依普利酮組及中藥組表達(dá)較模型組明顯減少，但基因敲除小鼠較野生小鼠表達(dá)明顯。
　　 3.2ColⅢ免疫組化檢測(cè)野生及基因敲除小鼠的假手術(shù)組腎臟可見少量表達(dá)，可見于腎小球及腎小管間質(zhì);模型組ColⅢ表達(dá)明顯增多，以間質(zhì)最為明顯，其中基因敲除小鼠甚于野生小鼠;依普利酮組及中藥組表達(dá)較相應(yīng)模型組明顯減少，但基因敲除小鼠較野生小鼠表達(dá)明顯。
　　 4.腎臟膠原組織天狼猩紅染色測(cè)定假手術(shù)組腎間質(zhì)可見膠原組織表達(dá)于腎小球、腎小管

19、及間質(zhì)，野生及基因敲除小鼠間無明顯差異;模型組表達(dá)明顯增多，主要見于腎小管間質(zhì)，皮質(zhì)及髓質(zhì)表達(dá)均明顯增強(qiáng)，ADM基因敲除小鼠表達(dá)尤為顯著;依普利酮組及中藥組表達(dá)較相應(yīng)模型組明顯減弱，但兩組中ADM基因敲除小鼠較野生小鼠表達(dá)明顯。
　　 第四部分:化瘀滌痰通絡(luò)中藥對(duì)腎間質(zhì)纖維化小鼠ADM表達(dá)的影響
　　 方法:動(dòng)物分組、模型復(fù)制、給藥方法同第一部分，共10天。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)留取腎臟，采用RT-PCR、Western-Blot、

20、免疫組化法檢測(cè)各組小鼠腎臟ADMmRNA及蛋白的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)學(xué)方法同第一部分。
　　 結(jié)果:
　　 1.腎組織ADMmRNA檢測(cè)野生及基因敲除小鼠中假手術(shù)組均有表達(dá)，但基因敲除小鼠的表達(dá)明顯低于野生小鼠(P＜0.01)。模型組顯著低于相應(yīng)假手術(shù)組(P＜0.01;P＜0.01)，其中基因敲除模型組明顯低于野生小鼠模型組(P＜0.01)。依普利酮組及中藥組ADM表達(dá)明顯高于相應(yīng)模型組（P均＜0.05）。
　　 2.腎組

21、織ADM蛋白檢測(cè)野生小鼠假手術(shù)組ADM表達(dá)明顯，基因敲除型假手術(shù)組表達(dá)減弱，與野生型有顯著差異（P＜0.01）;模型組ADM表達(dá)顯著低于相應(yīng)假手術(shù)組（P＜0.01;P＜0.01），基因敲除模型組明顯低于野生小鼠模型組(P＜0.01)。依普利酮組及中藥組ADM表達(dá)明顯高于相應(yīng)模型組(P＜0.05;P＜0.05)。
　　 3.腎組織ADM免疫組化檢測(cè)野生小鼠假手術(shù)組ADM表達(dá)較為廣泛，在皮質(zhì)及髓質(zhì)均有表達(dá)，且以髓質(zhì)表達(dá)為明顯，基因敲

22、除小鼠假手術(shù)組表達(dá)較野生小鼠假手術(shù)組明顯減弱;兩模型組ADM表達(dá)明顯減少，髓質(zhì)部減少更為明顯，且基因敲除小鼠較野生小鼠表達(dá)顯著減少，在髓質(zhì)部幾無表達(dá);依普利酮及中藥組ADM表達(dá)較相應(yīng)模型組增多，其中野生小鼠表達(dá)較基因敲除小鼠為多。
　　 結(jié)論:
　　 1.結(jié)扎單側(cè)輸尿管復(fù)制腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，腎間質(zhì)膠原成分顯著增多，其中ADM基因敲除UUO小鼠較野生小鼠更為明顯。依普利酮及中藥可抑制膠原沉積，抑制作用對(duì)野生小鼠更為

23、顯著。
　　 2.腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟TEMT標(biāo)志物α-SMA表達(dá)較假手術(shù)組明顯增多，其中基因敲除小鼠較野生小鼠為甚;化瘀滌痰通絡(luò)中藥及依普利酮可下調(diào)α-SMA在mRNA及蛋白水平的表達(dá)。
　　 3.化瘀滌痰通絡(luò)中藥可下調(diào)UUO腎間質(zhì)纖維化模型小鼠腎組織中TGF-β1、ColⅢmRNA及蛋白的表達(dá)，減少ECM沉積。
　　 4.腎間質(zhì)纖維化實(shí)驗(yàn)小鼠腎臟ADM表達(dá)較假手術(shù)組顯著降低，化瘀滌痰通絡(luò)中藥可上調(diào)其表達(dá)，