1、研究背景：膿毒癥導(dǎo)致的多器官衰竭，是重癥感染、燒傷、嚴(yán)重創(chuàng)傷等患者的主要死亡原因。但是其病理生理改變復(fù)雜，具體發(fā)病機(jī)制并不十分明確，給有效、針對(duì)的靶向性治療帶來(lái)一定困難。大量研究表明，免疫細(xì)胞凋亡是膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中免疫抑制狀態(tài)的主要原因。免疫抑制狀態(tài)導(dǎo)致機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)原發(fā)感染和繼發(fā)感染控制的失敗，從而導(dǎo)致死亡。其中，已證實(shí)膿毒癥導(dǎo)致的巨噬細(xì)胞凋亡，與其細(xì)菌清除能力和炎癥細(xì)胞因子釋放能力的下降有密切關(guān)系，是膿毒癥導(dǎo)致死亡的重要原因之一

2、。除了凋亡之外，另外一種細(xì)胞生物學(xué)行為，自噬，也在膿毒癥中激活，并被認(rèn)為發(fā)揮保護(hù)性作用，其保護(hù)機(jī)制可能與拮抗細(xì)胞凋亡的發(fā)生有關(guān)。對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)，在一定程度上，決定了膿毒癥的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后。干擾素調(diào)節(jié)因子-1(IRF-1)在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型中具有損傷性作用。IRF-1基因敲除的小鼠，腹腔內(nèi)注射LPS后，終末臟器損傷明顯減輕，死亡率明顯降低，其保護(hù)作用被證實(shí)與促炎癥因子TNF-α和IFN-γ釋放的減少有關(guān)。除

3、了促進(jìn)炎癥因子釋放外，IRF-1還是一種重要的促凋亡因子，可以促進(jìn)肝細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞、膽囊癌細(xì)胞等原代細(xì)胞或腫瘤細(xì)胞系的凋亡。但在膿毒癥模型中，IRF-1對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用，國(guó)內(nèi)外未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過(guò)LPS腹腔內(nèi)注射建立小鼠膿毒癥動(dòng)物模型，以LPS干預(yù)的鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞為體外模型，探討IRF-1對(duì)LPS誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞的凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用，并進(jìn)一步探討LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞IRF-1激活的信號(hào)傳

4、導(dǎo)通路，以及IRF-1調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞凋亡和自噬的機(jī)制。
　　 第一章小鼠膿毒癥模型中IRF-1對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用
　　 目的：腹腔內(nèi)注射LPS后，觀察IRF-1基因敲除(KO)小鼠和匹配的C57BL/6野生型(WT)小鼠的生存率及終末臟器損傷，并觀察各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞中凋亡和自噬的發(fā)生水平。
　　 方法：8-10周齡雄性野生型C57BL/6小鼠和IRF-1 KO小鼠，每組各

5、12只，腹腔內(nèi)注射LPS(20mg/kg)，建立膿毒癥動(dòng)物模型，觀察96h生存率。給予NS或LPS(20mg/kg)腹腔內(nèi)注射16h后，分別獲取各組小鼠肺組織，HE染色觀察肺組織病理學(xué)改變;同時(shí)，分別收集各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞、肺泡巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞，檢測(cè)凋亡和自噬的發(fā)生水平。Western blot檢測(cè)其cleaved caspase-3的水平、LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值;TUNEL法檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)的變化，激光共聚焦顯微

6、鏡(confocal)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞LC3B的顆粒聚集情況，電鏡(TEM)檢測(cè)腹腔巨噬細(xì)胞中線粒體損傷和自噬的發(fā)生情況，
　　 結(jié)果：WT小鼠腹腔內(nèi)注射LPS后，96h的生存率為25％。而IRF-1KO小鼠，腹腔內(nèi)注射LPS后，無(wú)死亡現(xiàn)象發(fā)生，急性肺損傷明顯改善。Western blot結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，給予LPS刺激后，IRF-1 KO小鼠中，肺泡巨噬細(xì)胞、脾臟巨噬細(xì)胞、腹腔巨噬細(xì)胞的cleavedcaspase-3

7、水平明顯降低，而LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值明顯增高。此外， TUNEL法顯示，較WT小鼠，IRF-1 KO組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯降低。TEM結(jié)果顯示，較WT小鼠，IRF-1 KO組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞自噬發(fā)生水平明顯增高。共聚焦顯微鏡亦證實(shí)，IRF-1 KO組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中LC3B的熒光強(qiáng)度和聚集程度增高。
　　 結(jié)論：采用腹腔內(nèi)注射LPS的方法，成功建立了小鼠膿毒癥模型。IRF-1基因敲除顯著改善了膿毒癥小鼠的預(yù)后和終末臟器

8、損傷。在膿毒癥模型中，IRF-1參與了小鼠巨噬細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)。較WT小鼠相比，IRF-1 KO小鼠的巨噬細(xì)胞凋亡發(fā)生水平明顯降低，自噬的發(fā)生水平明顯提高。IRF-1對(duì)巨噬細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)，可能是其影響膿毒癥預(yù)后的重要原因。
　　 第二章自噬對(duì)LPS誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞損傷的保護(hù)性作用研究
　　 目的：驗(yàn)證巨噬細(xì)胞自噬在膿毒癥模型中的作用，觀察自噬對(duì)LPS誘導(dǎo)的鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞損傷

9、的保護(hù)性作用。
　　 方法：分別使用自噬抑制劑3-MA(5mM)和Beclin-1 siRNA抑制鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞自噬的發(fā)生水平，給予LPS(500ng/ml)刺激16h后，Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值和cleaved caspase-3水平，使用MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞活力。
　　 結(jié)果：較對(duì)照組，LPS處理后RAW264.7細(xì)胞的自噬水平明顯增高，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值增加。使用自噬抑制

10、劑3-MA預(yù)處理，以及使用siRNA特異性干擾自噬相關(guān)蛋白Beclin-1表達(dá)后，LPS誘導(dǎo)的自噬發(fā)生明顯受到抑制，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值明顯降低，cleaved caspase-3水平明顯增高。MTT結(jié)果顯示抑制自噬后，LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡明顯加重。
　　 結(jié)論：使用自噬抑制劑3-MA或是小干擾RNA抑制自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，均可以明顯抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞自噬的發(fā)生，促進(jìn)其凋亡的發(fā)生。抑制自噬后，LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞死亡明顯加

11、重，提示自噬在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞損傷中具有保護(hù)性作用，其保護(hù)作用可能與拮抗凋亡的發(fā)生有關(guān)。
　　 第三章LPS誘導(dǎo)鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞IRF-1的表達(dá)及信號(hào)傳導(dǎo)通路研究
　　 目的：觀察LPS誘導(dǎo)的鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞中IRF-1的表達(dá)，并探討其信號(hào)傳導(dǎo)通路。
　　 方法：第一部分，體外培養(yǎng)RAW264.7細(xì)胞，使用LPS(500ng/ml)刺激不同時(shí)間(0-8h)后，Western b

12、lot檢測(cè)IRF-1的表達(dá)水平。使用不同濃度的LPS(10ng/ml—1000 ng/ml)刺激4h后，Western blot檢測(cè)IRF-1的表達(dá)水平。第二部分，將RAW264.7細(xì)胞分成四組:controlsiRNA組，TLR4 siRNA組，LPS+control siRNA組，以及LPS+TLR4 siRNA組。siRNA轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞24h后，使用LPS(500ng/ml)刺激4h，Western blot檢測(cè)IRF

13、-1和TLR4的表達(dá)水平。第三部分，將RAW264.7細(xì)胞分成四組:control siRNA組，TRIF siRNA組，LPS+control siRNA組，以及LPS+TRIF siRNA組。siRNA轉(zhuǎn)染及LPS刺激同上，Western blot檢測(cè)IRF-1和TRIF的表達(dá)水平。第四部分，將RAW264.7細(xì)胞分成四組:control siRNA組，MyD88 siRNA組，LPS+control siRNA組，以及LPS+My

14、D88 siRNA組。siRNA轉(zhuǎn)染及LPS刺激同上，Western blot檢測(cè)IRF-1和MyD88的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞的IRF-1表達(dá)，呈時(shí)間、劑量依賴性，其在LPS刺激4h后表達(dá)達(dá)峰;在LPS濃度為500ng/ml表達(dá)達(dá)峰，繼續(xù)增加LPS的量并不能提高IRF-1的表達(dá)。小干擾RNA干預(yù)TLR4、TRIF、MyD88表達(dá)后，Western blot檢測(cè)顯示，較controlsiRNA轉(zhuǎn)染

15、組，TLR4 siRNA、TRIF siRNA、MyD88 siRNA轉(zhuǎn)染組，TLR4、TRIF、MyD88的表達(dá)明顯下降。LPS+TLR4 siRNA組和LPS+TRIF siRNA組，較LPS+control siRNA組，Western blot檢測(cè)顯示IRF-1表達(dá)明顯下降。而LPS+MyD88siRNA組，較LPS+controlsiRNA組，IRF-1的表達(dá)水平無(wú)明顯變化。
　　 結(jié)論：LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞

16、IRF-1的表達(dá)呈時(shí)間依賴性和劑量依賴性。LPS通過(guò)TLR4—TRIF依賴性、MyD88非依賴性信號(hào)通路誘導(dǎo)IRF-1的表達(dá)。
　　 第四章IRF-1/NO調(diào)節(jié)鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞凋亡和自噬及其機(jī)制研究
　　 目的：觀察IRF-1及其下游因子NO對(duì)鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞凋亡和自噬的調(diào)節(jié)作用，并探討其作用機(jī)制。
　　 方法：第一部分，使用腺病毒AdIRF-1和AdlacZ，按照不同的MOI(1

17、00，200)感染RAW264.7細(xì)胞48h。Western blot檢測(cè)IRF-1表達(dá)。選擇MOI為200感染RAW264.7細(xì)胞48h后，Western blot檢測(cè)pmTOR，mTOR，p-P70S6，P70S6，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值以及cleavedcaspase-3，8，9的表達(dá)水平。使用試劑盒檢測(cè)caspase-3活性，使用Arrayscan檢測(cè)細(xì)胞中LC3B的顆粒聚集情況。第二部分，使用腺病毒AdIRF-1和AdlacZ按

18、照MOI為200感染RAW264.7細(xì)胞48h后，收集細(xì)胞及上清液。Western blot檢測(cè)iNOS表達(dá)，Griess Assay檢測(cè)上清液中NO的含量。第三部分，使用內(nèi)源性NO供體SNAP，按照不同的濃度(100μM—800μM)處理RAW264.7細(xì)胞16h后，Westernblot檢測(cè) pmTOR，mTOR，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值以及cleaved caspase-3，8，9的表達(dá)水平。使用試劑盒檢測(cè)caspase-3活性，使用

19、Arrayscan檢測(cè)細(xì)胞中LC3B的顆粒聚集情況。第四部分，使用iNOS抑制劑L-NIL(200μM)預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h后，給予LPS(500ng/ml)刺激16h。Western blot檢測(cè)LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值以及cleaved caspase-3的表達(dá)水平。使用試劑盒檢測(cè)caspase-3活性，使用Arrayscan檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)LC3B的顆粒聚集情況。
　　 結(jié)果：與病毒載體AdlacZ相比，腺病毒AdIRF-

20、1感染48h可以誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞特異性高表達(dá)IRF-1，而且不產(chǎn)生明顯的細(xì)胞毒性，因此選擇該MOI進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。與AdlacZ組相比，AdIRF-1感染RAW264.7細(xì)胞后，Western blot顯示， pmTOR/p-P70S6蛋白表達(dá)水平增高，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值降低。Arrayscan顯示AdIRF-1感染組，LC3B顆粒聚集被顯著抑制。同時(shí)，Western blot顯示AdIRF-1感染組，cleaved caspa

21、se-8，9，3水平顯著提高，caspase-3活性顯著提高。AdIRF-1感染RAW264.7細(xì)胞48h后，Western blot顯示iNOS顯著激活，Griess Assay顯示上清液中NO含量明顯增加，證實(shí)在RAW264.7細(xì)胞中，IRF-1是iNOS/NO的上游調(diào)節(jié)因子。采用無(wú)血清的培養(yǎng)液預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞12h后，使用不同劑量的內(nèi)源性NO供體SNAP處理RAW264.7細(xì)胞16h，Western blot顯示pmTO

22、R蛋白表達(dá)水平增高，LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值明顯降低，Arrayscan顯示SNAP處理組，LC3B顆粒聚集被顯著抑制，該反應(yīng)呈劑量依賴性。同時(shí)，Western blot顯示SNAP處理組，cleaved caspase-8，9，3水平顯著提高，caspase-3活性顯著提高，該反應(yīng)亦呈劑量依賴性。使用iNOS抑制劑L-NIL預(yù)處理RAW264.7細(xì)胞1h，隨后給予LPS刺激。較LPS處理組，L-NIL預(yù)處理后， LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值明顯增

23、高，cleaved caspase-3激活被抑制。Arrayscan顯示L-NIL預(yù)處理組，LC3B顆粒聚集顯著增多，caspase-3活性顯著降低。
　　 結(jié)論：IRF-1及其下游因子NO，通過(guò)激活mTOR/P70S6通路抑制鼠巨噬細(xì)胞株RAW264.7細(xì)胞自噬的發(fā)生。同時(shí)，IRF-1/NO通過(guò)激活cleaved caspase-9，8，進(jìn)一步激活cleaved caspase-3，參與了內(nèi)源性凋亡和外源性凋亡途徑，從而促進(jìn)R