1、目的:
　　通過(guò)對(duì)PCNA啟動(dòng)子不同區(qū)段在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系及永生化非腫瘤細(xì)胞系中轉(zhuǎn)錄效率的定性定量檢測(cè)，篩選出攜帶增殖特異性的區(qū)段，并通過(guò)對(duì)該區(qū)段的改造進(jìn)一步提高轉(zhuǎn)錄效率及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)穩(wěn)定性，以構(gòu)建一個(gè)可用于惡性膠質(zhì)瘤基因治療的增殖特異性啟動(dòng)子，使其適用于啟動(dòng)外源性抑癌基因、反義RNA等表達(dá)和介導(dǎo)內(nèi)源性致癌基因RNA沉默的shRNA表達(dá)。
　　方法:
　　1.以人基因組DNA為模板，應(yīng)用PCR方法擴(kuò)增出PCNA啟動(dòng)子-

2、778bp～+122bp、-538～+62、-256～+62多個(gè)區(qū)段。2.將其克隆入綠色熒光蛋白報(bào)告基因載體pEGFP-1中，分別轉(zhuǎn)染膠質(zhì)瘤細(xì)胞系TJ905和永生化非腫瘤細(xì)胞系293，定性觀察綠色熒光蛋白的表達(dá)。3.將其克隆入熒光素酶報(bào)告載體pGL3—Basic、pGL3—Ehance中，利用熒光素酶檢測(cè)試劑盒定量觀察上述片段在TJ905和293中的轉(zhuǎn)錄活性。4.改造900bp區(qū)段，構(gòu)建啟動(dòng)子PTAI，測(cè)序正確后轉(zhuǎn)染TJ905和293細(xì)

3、胞系，定性定量觀察并與上述PCNA不同區(qū)段進(jìn)行對(duì)比，以確定該載體的轉(zhuǎn)錄效率和增殖特異性。
　　結(jié)果:
　　1.瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR克隆的PCNA啟動(dòng)子片段大小正確，測(cè)序完整無(wú)突變。2.對(duì)綠色熒光蛋白和熒光素酶的定性定量觀察顯示，上述啟動(dòng)子均能介導(dǎo)報(bào)告基因的表達(dá)，但各區(qū)段的轉(zhuǎn)錄活性各不相同。900bp在TJ905和293中的轉(zhuǎn)錄效率明顯高于600bp和300bp。在TJ905中900bp的轉(zhuǎn)錄效率明顯高于293中的轉(zhuǎn)錄活性

4、。3.限制性酶切分析和DNA測(cè)序證實(shí)PTAI改造成功。4.通過(guò)對(duì)綠色熒光蛋白和熒光素酶的定性定量檢測(cè)，PTAI在TJ905中轉(zhuǎn)錄活性明顯高于900bp，特別是加入增強(qiáng)子后活性更強(qiáng)，但其在293中的轉(zhuǎn)錄活性兩者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　克隆及改造的人PCNA啟動(dòng)子的不同區(qū)段在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中有高效啟動(dòng)活性。特別是加入SV40增強(qiáng)子后其轉(zhuǎn)錄活性增加5～8倍，同時(shí)不影響其增殖特異性，有可能成為潛在的活性更高的腫瘤特異性啟動(dòng)子系統(tǒng)