1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是一種部分雙鏈環(huán)狀嗜肝DNA病毒，宿主范圍狹窄，主要是靈長類中的人類和大猩猩。HBV在人類可引起急、慢性乙型肝炎、肝纖維化、并與原發(fā)性肝細胞癌的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。α-干擾素(lnterferon-α，IFN-α)仍是目前最常用的治療乙型肝炎病毒感染的藥物。它通過建立細胞內(nèi)抗病毒狀態(tài)和免疫調(diào)節(jié)作用抑制并清除病毒。但臨床發(fā)現(xiàn)約2/3的患者表現(xiàn)為對α-干擾素治療無反應(yīng)，即沒有出現(xiàn)Hbe

2、Ag血清轉(zhuǎn)換和血清HBV DNA水平降低，除了宿主因素外還與病毒本身抗干擾素作用有關(guān)。目前比較明確的是HBV DNA聚合酶的抗干擾素作用。Foster等發(fā)現(xiàn)，表達HBV DNA聚合酶末端蛋白可顯著抑制細胞對α-干擾素反應(yīng)，并認為是由于TP表達阻斷α-干擾素通路引起，但其抗IFN-α作用的功能區(qū)域迄今尚不清楚。 中國地區(qū)HBV感染主要為B基因型及C基因型，臨床資料顯示，B基因型HBV感染對干擾素治療的反應(yīng)好于C基因型，我們通過對大

3、樣本HBV DNA聚合酶區(qū)氨基酸序列分析后發(fā)現(xiàn)，B、C基因型HBV DNA聚合酶在TP區(qū)及Spacer區(qū)分別存在14及44個氨基酸差異，目前尚不清楚這些氨基酸差異是否與B、C基因型HBV感染對干擾素治療反應(yīng)差異有關(guān)。 另TP位于DNA聚合酶的氨基端，通常情況下只能以DNA聚合酶的形式出現(xiàn)，并不存在單獨游離的TP。但隨著擴增HBV全基因組DNA方法的建立，在乙肝患者中分離到多種HBV基因組剪接變異體、缺失突變體。其中在2309nt

4、以后發(fā)生剪接和缺失的HBV亞基因組DNA能編碼TP相關(guān)蛋白(HBV DNA聚合酶的編碼區(qū)起始于2309 nt)。對于這些剪接和缺失的HBV亞基因組DNA及其編碼的各種TP相關(guān)蛋白的抗干擾素作用還未有過系統(tǒng)研究。為此，本研究內(nèi)容包括三部分： (一)乙型肝炎病毒TP+Spacer抗干擾素作用功能區(qū)域分析以HBV全基因組DNA重組質(zhì)粒FMU013為模板，PCR擴增獲得DNA聚合酶TP+Spacer區(qū)各功能區(qū)基因片段，克隆到真核表達載體

5、pcDNA3.1/HisC中，構(gòu)建各功能區(qū)缺失突變體，與干擾素反應(yīng)報告質(zhì)粒p6-16CAT共轉(zhuǎn)染Huh7肝細胞，檢測干擾素處理后CAT表達改變，確定抗IFN-α反應(yīng)的功能區(qū)域。 (二)比較B、C基因型TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用的強弱 收集干擾素治療有反應(yīng)、無反應(yīng)慢性乙型肝炎患者治療前血清，抽提血清DNA，以限制性片段長度多態(tài)性方法確定基因型。PCR獲得各B、C基因型標(biāo)本TP+Spacer區(qū)N端257aa基因片段，克隆到真核

6、表達載體pcDNA3.1/HisC中。各重組表達載體與干擾素反應(yīng)報告質(zhì)粒p6-16CAT共轉(zhuǎn)染Huh7肝細胞，檢測干擾素處理后CAT表達改變，比較B、C基因型TP+Spacer區(qū)抗干擾素作用差別 (三)乙型肝炎病毒剪接變異缺失突變體編碼的TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用 收集中、重度慢性乙型肝炎患者血清，抽提血清DNA，PCR擴增HBV基因組DNA克隆到pUC18載體中并測序。與標(biāo)準(zhǔn)株HBV序列進行相似性比較，分析其結(jié)構(gòu)，找出符

7、合本研究的所有可能存在的剪接變異類型(在2309nt以后發(fā)生剪接)和各種缺失突變體(在2309nt以后發(fā)生缺失)，克隆各剪接變異體和缺失突變所編碼的TP相關(guān)蛋白基因到真核表達載體pcDNA3.1/HisC中，各TP相關(guān)蛋白基因重組載體與干擾素反應(yīng)報告質(zhì)粒p6-16CAT共轉(zhuǎn)染Huh7肝細胞，檢測干擾素處理后CAT表達改變，確定各TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用并分析其發(fā)揮抗干擾素作用的功能區(qū)域。 本研究確定了：TP相關(guān)蛋白抗干擾素作用的