1、四氫吡咯二硫代氨基甲酸酯對(duì)百草枯致大鼠肺損傷的干預(yù)作用百草枯(Paraquat,PQ),又名克蕪蹤(Gramoxone),化學(xué)名為l,1,-二甲基-4,4,-聯(lián)吡啶陽(yáng)離子鹽(1,1,-dimethyl-4,4,-bipyridylium),是目前全球使用最廣的除草劑之一。肺臟是PQ中毒的主要靶器官,表現(xiàn)為早期的急性肺損傷,晚期的肺泡內(nèi)和肺間質(zhì)纖維化,被命名為“百草枯肺”,呼吸衰竭是PQ中毒的主要死因。國(guó)外報(bào)道病死率為40％～50％,國(guó)內(nèi)

2、報(bào)道病死率達(dá)60％87．5％,是致死性最高的農(nóng)藥中毒事件。迄今為止各國(guó)學(xué)者仍未明了百草枯的中毒機(jī)制,亦無(wú)有效拮抗藥物。近年來(lái),氧化損傷、核因子-kappaB(nuclearfactor-kappaB,NF-kB)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、肺細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)成為急性肺損傷、肺纖維化機(jī)制研究中的的熱點(diǎn)問(wèn)題。本研究通過(guò)分析氧化應(yīng)激、NF-kB與細(xì)胞因子、結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(connectivetissuegrowthfactor,CTGF),及其下游效應(yīng)基因在

3、PQ致大鼠肺損傷中的表達(dá)水平及變化規(guī)律,探討PQ中毒致肺損傷尤其是肺纖維化機(jī)制,找出PQ中毒的關(guān)鍵點(diǎn);并通過(guò)四氫吡咯二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidinedithiocarbamate,PDTC)的干預(yù),在驗(yàn)證PQ致肺損傷機(jī)制假設(shè)的同時(shí),探討PDTC的干預(yù)效果及可能機(jī)制,為尋找潛在的有效治療途徑提供理論基礎(chǔ)和線索。
　　本課題包括PQ致肺損傷機(jī)制研究與PDTC對(duì)PQ致肺損傷的干預(yù)作用兩部分內(nèi)容。通過(guò)建立整體動(dòng)物模型,SD大鼠14

4、4只隨機(jī)分為對(duì)照組6只、PDTC對(duì)照組36只、PQ染毒組56只、PDTC干預(yù)組46只。染毒組和干預(yù)組給予生理鹽水稀釋PQ80mg/kg一次性灌胃后2h,干預(yù)組給予PDTCl00mg/kg一次性腹腔注射,染毒組給予等量生理鹽水腹腔注射;對(duì)照組和PDTC對(duì)照組于生理鹽水1ml/kg灌胃后2h,PDTC對(duì)照組給予PDTCl00mg/kg一次性腹腔注射,對(duì)照組給予等量生理鹽水腹腔注射。于不同處理后l、3、7、14、25、56d觀察大鼠中毒表現(xiàn)及

5、采集血清、肺組織樣本。采用試劑盒檢測(cè)血清谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化氫酶(CAT)、丙二醛(MDA)、髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性以及肺組織羥脯氨酸(Hyp)含量;組織微列陣(TMA)免疫組化檢測(cè)NF-kBp65的細(xì)胞定位及表達(dá)強(qiáng)度、電泳遷移率改變分析法(EMSA)檢測(cè)肺組織NF-kB活性及變化規(guī)律;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清中細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1B(IL-1B)、腫瘤壞死因子-a(TNF

6、-a)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-B1(TGF-p1)及血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)的水平及變化規(guī)律;SABC免疫組化觀察肺組織結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、a-平滑肌肌動(dòng)蛋白(a-SMA)的細(xì)胞定位和表達(dá)強(qiáng)度、免疫印跡法fWesternblot)檢測(cè)CTGF、a-SMA蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化;采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-PCR)檢測(cè)肺組織纖維連接蛋白(Fn)、整合素a5、I型膠原(ColI)mRNA水平;HE、Masson染色進(jìn)行肺組織病理學(xué)觀察

7、及半定量分析、透射電鏡進(jìn)行肺組織超微結(jié)構(gòu)觀察。
　　PQ染毒對(duì)氧化還原平衡影響的研究顯示:(1)染毒組大鼠在染毒后1d血清MDA含量急劇上升,之后逐漸下降。與對(duì)照組和PDTC對(duì)照組比較,l、3、7dMDA含量明顯高于對(duì)照組(P＜0．01);干預(yù)組與染毒組比較,MDA含量3、7d明顯降低(P＜0.01),與兩個(gè)對(duì)照組比較,MDA含量1、3、7d咀顯升高(P＜0.01)。(2)大鼠染毒后GPx活力呈先降低后逐漸上升的趨勢(shì)。與對(duì)照組和P

8、DTC對(duì)照組比較,染毒組1、3、7、14dGPx活力降低(P＜O．05或P＜0．01);干預(yù)組與染毒組比較,l、3、7、14dGPx活力升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01),與兩個(gè)對(duì)照組比較,僅3、7dGPx活力降低(P＜0.05或P＜0．01)。(3)大鼠染毒后ld血清SOD活力急劇下降,之后逐漸上升。與對(duì)照組和PDTC對(duì)照組比較,染毒組l、3、7dSOD活力明顯下降(p＜0．01);干預(yù)組1、3、7d活力明顯升高(P＜0．05或P

9、＜0．01),但低于對(duì)照組水平(P＜0．01)。(4)大鼠染毒后1、3dCAT活力迅速下降,之后逐漸上升。與對(duì)照組和PDTC對(duì)照組比較,染毒組l、3、7dCAT活力明顯降低(P＜0．01);干預(yù)組與染毒組比較,1、3dCAT活力較高(P＜0.01),但低于對(duì)照組水平(P＜0．01)。(5)大鼠染毒后1～14d血清MPO活力逐漸上升,28d開(kāi)始下降但維持在較高水平。與對(duì)照組和PDTC對(duì)照組比較,染毒組各時(shí)點(diǎn)的MPO活性均顯著升高(P＜0.

10、01);干預(yù)組各時(shí)點(diǎn)的MPO活性降低,但僅14d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05),與對(duì)照組比較,l、3、7、14d活性升高(P＜0．05)。
　　PQ染毒對(duì)肺組織NF-kB活性及血清相關(guān)細(xì)胞因子水平影響的研究顯示:(1)肺組織NF-kB活性變化顯示,NF-kBp65陽(yáng)性細(xì)胞主要在支氣管粘膜柱狀上皮纓胞、肺泡上皮、巨噬纓胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞的胞漿或,和胞核里表達(dá);蛋白表達(dá)強(qiáng)度及變化規(guī)律與EMSA檢測(cè)結(jié)果較為一致。對(duì)照組NF-kB

11、活性極低。染毒組大鼠肺組織NF-kB活性于1d明顯升高,3d達(dá)到高峰,7、14d逐漸降低,但仍維持在較高水平,28d迅速降低,接近對(duì)照組的水平。與對(duì)照組比較,染毒組肺組織NF-kBl、3、7、14d活性明顯升高(P＜0.05或P＜0.01);干預(yù)組大鼠肺組織NF-kB活性變化規(guī)律與染毒組類似,1、3、7、14d活性較染毒組明顯降低p＜0．05或P＜0．01),但1、3、7d活性高于對(duì)照組(P＜0．05或P＜0．01)。(2)血清細(xì)胞因子

12、水平顯示,與對(duì)照組比較,染毒組大鼠血清IL-IB水平于l、3、7d明顯升高(P＜0．01);TGF-B1、TNF-c水平各時(shí)點(diǎn)均顯著升高(P＜0.01);PDGF含量于7、14、28、56d明顯升高(P＜0．01);經(jīng)PDTC干預(yù)后,血清IL-1B、TGF-B1、TNF-a、PDGF水平明顯降低,相應(yīng)時(shí)點(diǎn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．05或P＜0．01)。(3)相關(guān)性分析顯示,1L-lB水平與肺臟系數(shù)成正相關(guān)(r=0．37,P＜0．05),

13、TNF-a水平與肺臟系數(shù)成正相關(guān)(r=0．46,P＜0．01),TGF-B1水平與Hyp含量成正相關(guān)(r=0．56,P＜0．01),PDGF水平與Hyp含量成正相關(guān)(r=0．89,P＜0．01)。
　　PQ染毒對(duì)CTGF、a-SMA及其下游效應(yīng)基因表達(dá)水平的影響:(1)免疫組化顯示,染毒組3d即有CTGF陽(yáng)性表達(dá),表達(dá)強(qiáng)度較弱,主要表達(dá)于肺泡上皮細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及以巨噬細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞等;7、14d表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng),主要表達(dá)部位

14、除上述細(xì)胞外出現(xiàn)成纖維細(xì)胞;28、56d表達(dá)持續(xù)增強(qiáng),主要表達(dá)部位為巨噬細(xì)胞和大量成纖維細(xì)胞。干預(yù)組CTGF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞與染毒組相同,但各時(shí)段表達(dá)強(qiáng)度均顯著降低(P＜0．05或P＜0．01)。染毒組3、7d在肺泡間隔中開(kāi)始出現(xiàn)少量a-SMA免疫反應(yīng)陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞;14d隨著纖維組織增生,a-SMA免疫反應(yīng)陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞大量出現(xiàn),表達(dá)強(qiáng)度急劇增強(qiáng);28～56d隨著大面積纖維組織出現(xiàn),a-SMA免疫反應(yīng)陽(yáng)性的成纖維細(xì)胞繼續(xù)增多,表達(dá)持續(xù)

15、增強(qiáng)。干預(yù)組CTGF陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞明顯減少,各時(shí)點(diǎn)表達(dá)強(qiáng)度顯著降低(p＜0．05或P＜0．01)。(2)Westernblot顯示,染毒后大鼠肺組織的CTGF、a-SMA蛋白表達(dá)的變化規(guī)律與免疫組化較為一致,均隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高,3～7d升高幅度緩慢,14～56d增幅較大,各時(shí)段明顯高于對(duì)照組(P＜0．05或．P＜0．01);PDTC干預(yù)后CTGF、a-SMA蛋白表達(dá)在各時(shí)段均顯著下降(P＜O．05或P＜0．01)。(3)RT-PCR顯

16、示,染毒后大鼠肺組織Fn,ColI,整合素a5mRNA表達(dá)水平均明顯升高,其中Fn、整合素a5mRNA變化規(guī)律類似,均表現(xiàn)為染毒1、3d基因表達(dá)即刻增高,但增幅平緩,14～56d增幅劇烈。與對(duì)照組比較,染毒組FnmRNA水平各時(shí)段均明顯升高(P＜0．05或P＜0．01);整合素a5mRNA3～56d基因表達(dá)顯著增強(qiáng)(P＜0．05或P＜0．01);1、3dColImRNA表達(dá)無(wú)明顯變化,7d表達(dá)略微增強(qiáng),14～56dColImRNA水平大

17、幅度升高,與對(duì)照組比較3～56dmRNA水平明顯升高(p＜0．05或P＜0．01)。PDTC干預(yù)后顯著降低大鼠肺組織各時(shí)段的Fn,ColI,整合素a5mRNA水平(P＜0．05或．P＜0．01)。(4)相關(guān)性分析顯示,CTGF與病理評(píng)分、Hyp含量成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)分別為0．87、0．71(P＜0．01);與a-SMA蛋白水平、Fn、ColI、整合素a5mRNA水平均為顯著的正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0．74、0．68、0．83、0．7

18、4(P＜0．01)。A-SMA與病理評(píng)分、Hyp含量成正相關(guān),相關(guān)系數(shù)為0．68、0．88(P＜0．01)。
　　病理學(xué)檢測(cè)顯示,PQ中毒后肺損傷病理改變分為損傷期和增殖期。(1)光鏡觀察:染毒早期(1～7d)病理特征為急性肺泡炎,表現(xiàn)為肺充血、肺水腫及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。后期(14～56d)炎性病變減輕,支氣管周圍、肺泡間隔及肺泡內(nèi)大量成纖維細(xì)胞增殖、膠原纖維不規(guī)則排列,病變嚴(yán)重處見(jiàn)纖維瘢痕樣組織,無(wú)肺泡結(jié)構(gòu)。干預(yù)組的肺部炎性改變及膠

19、原纖維增生程度均明顯減輕。(2)電鏡觀察:染毒組大鼠部分肺泡I型上皮細(xì)胞受損,II型上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落、基膜斷裂,細(xì)胞核染色質(zhì)邊集,線粒體腫脹,板層小體排空現(xiàn)象明顯,以3、7d變化最為明顯。后期可見(jiàn)線粒體結(jié)構(gòu)破壞,板層小體空泡化,膠原纖維不規(guī)則排列。PDTC干預(yù)后上述病變程度明顯減輕。
　　肺臟系數(shù)及肺組織Hyp含量檢測(cè)顯示,染毒組大鼠肺臟系數(shù)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,7d達(dá)到高峰,14d迅速下降,28、56d再次呈現(xiàn)升高趨勢(shì),各

20、時(shí)段均明顯高于對(duì)照組(P＜0．01);干預(yù)組3、7、28、56d肺臟系數(shù)明顯降低(P＜0．01),但各時(shí)段肺臟系數(shù)高于對(duì)照組(P＜0.01)。染毒組與干預(yù)組肺組織Hyp含量均于7d后逐漸升高。與對(duì)照組比較,染毒組14、28、56d肺組織Hyp含量明顯升高(P＜0．01);干預(yù)組28、56d肺組織Hyp含量與染毒組比較明顯降低,但高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　綜上,氧化應(yīng)激是參與PQ致早期肺損傷盼重要機(jī)制;作為

21、NF-kB的刺激因素之一,通過(guò)誘導(dǎo)NF-kB活化,導(dǎo)致細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控失衡、相關(guān)細(xì)胞因子過(guò)度表達(dá),參與PQ所致的急性肺損傷/肺纖維化發(fā)生發(fā)展:其中TGF-B1作為纖維化的“總開(kāi)關(guān)”細(xì)脆因子,它可能通過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路誘導(dǎo)CTGF持續(xù)過(guò)度表達(dá),使其作為下游效應(yīng)分子介導(dǎo)其促纖維化效應(yīng),表現(xiàn)為a-SMA蛋白的表達(dá)增強(qiáng),FN、Coll、整合素a5mRNA水平的顯著升高,最終導(dǎo)致肺成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化及細(xì)胞外基質(zhì)的沉積。PDTC作為強(qiáng)抗氧化劑及N