1、背景:
　　喉癌是上呼吸道最常見的惡性腫瘤，占頭頸部腫瘤的25％左右。傳統(tǒng)的喉癌治療手段為根治性手術(shù)或放射治療，輔以或不輔以化學(xué)治療，但是傳統(tǒng)治療手段導(dǎo)致的喉功能部分甚至全部喪失或嚴(yán)重的副反應(yīng)極大地影響了患者的生存質(zhì)量，且仍有部分患者出現(xiàn)治療后復(fù)發(fā)。盡管手術(shù)術(shù)式、放療方法及化療方案在革新中不斷進(jìn)步，近30年來患者的生存率并無明顯改善。而失去根治性治療機(jī)會(huì)的晚期患者多行姑息性化療，長(zhǎng)期以來該期患者的5年生存率始終停留在30％左右。<

2、br>　　近20年來，分子靶向治療作為一種新型的治療手段在腫瘤的治療中取得了重大突破。對(duì)于頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma，HNSCC)，最具代表性的分子靶向藥物為特異性抑制表皮生長(zhǎng)因子受體(EpidermalGrowth Factor Receptor, EGFR)的單克隆抗體及小分子酪氨酸激酶抑制劑。然而以吉非替尼為代表的小分子抑制劑對(duì)HNSCC并無明確療效，而以西妥西單抗

3、為代表的單克隆抗體雖然對(duì)傳統(tǒng)的放、化療起到一定的輔助作用，然而由于有限的反應(yīng)率，較高的耐藥率及頻發(fā)的皮膚毒性、消化道癥狀等副作用使得該類藥物的應(yīng)用空間仍然不大。
　　隨著分子克隆技術(shù)的進(jìn)步，以病毒為表達(dá)載體，通過RNA干擾技術(shù)特異性下調(diào)EGFR表達(dá)的基因治療策略為腫瘤的治療開辟了新的方向。而隨著RNA干擾技術(shù)的不斷改進(jìn)，目前已出現(xiàn)人工microRNA(artificial microRNA，amiR)，即第二代shRNA，與siR

4、NA及第一代shRNA相比，人工microRNA在保留第一代shRNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，加入了天然microRNA的框架，除了更高效之外，最大的優(yōu)勢(shì)在于可以被哺乳動(dòng)物體內(nèi)大多數(shù)的啟動(dòng)子所啟動(dòng)。而人工microRNA的這一優(yōu)勢(shì)使得采用腫瘤組織特異性啟動(dòng)子來調(diào)控靶向EGFR的RNA干擾成為可能。
　　基于以上研究背景，我們擬設(shè)計(jì)以EGFR為靶點(diǎn)的人工microRNA，并利用重組腺病毒為載體，通過喉癌特異性的SLPI啟動(dòng)子調(diào)控該人工mi

5、croRNA的表達(dá)，并以Hep-2為研究對(duì)象，探討該基因治療策略抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。
　　目的:
　　構(gòu)建荷載有在SLPI啟動(dòng)子調(diào)控下的靶向EGFR的人工microRNA的重組腺病毒載體，并研究其安全性及對(duì)喉癌細(xì)胞的體內(nèi)外抑制作用。
　　方法:
　　1.構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA，Ad-SLPI-GFP-pA，分別與骨架質(zhì)粒pBGHlox(delta) E1，3Cre共轉(zhuǎn)染H

6、EK293細(xì)胞進(jìn)行腺病毒包裝。以PCR，westem blot等方法鑒定重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR，Ad-SLPI-GFP。擴(kuò)增病毒，并以CsCl密度梯度離心法純化擴(kuò)增的腺病毒，TCID50法測(cè)定病毒滴度。
　　2.將重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR及對(duì)照病毒Ad-SLPI-GFP分別感染人喉鱗狀上皮癌細(xì)胞株Hep-2和人正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株HuVEC，通過顯微鏡觀察，MTT，流式細(xì)胞儀細(xì)胞凋亡分析檢測(cè)病

7、毒對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2及正常細(xì)胞HuVEC增殖的影響。
　　3.建立裸鼠喉癌荷瘤模型，予瘤內(nèi)注射重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR、Ad-SLPI-GFP，或每日口服吉非替尼。比較治療過程中各組瘤體體積變化及觀察期結(jié)束后的瘤體重量。觀察治療過程中裸鼠的飲食、活動(dòng)及精神狀態(tài)，并比較裸鼠體重的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR，Ad-SLPI-GFP的包裝，鑒定、擴(kuò)增、純化及

8、滴度測(cè)定腺病毒穿梭質(zhì)粒pDC312-SLPI-EGFRamiR-pA、 pDC312-SLPI-GFP-pA分別與骨架質(zhì)粒pBGHlox(delta) E1，3Cre共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染第13天左右，倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)80％以上的細(xì)胞都發(fā)生細(xì)胞病變效應(yīng)，呈葡萄狀，貼壁不牢易脫落。收集感染細(xì)胞，反復(fù)凍融，病毒上清經(jīng)蛋白酶K處理后，PCR檢測(cè)示Ad-SLPI-EGFRamiR擴(kuò)增出不同重復(fù)序列數(shù)的EGFRamiR片段，142bp

9、、284bp、426bp片段，Ad-SLPI-GFP擴(kuò)增出1482bp片段，示重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR及對(duì)照病毒Ad-SLPI-GFP構(gòu)建成功。予擴(kuò)增純化后進(jìn)行滴度測(cè)定。Ad-SLPI-EGFRamiR滴度為1×1010pfu/ml，Ad-SLPI-GFP滴度為6.3×109pfu/ml。
　　Western blot結(jié)果顯示，Ad-SLPI-EGFRamiR病毒作用72小時(shí)的Hep-2細(xì)胞，170kdEGFR表

10、達(dá)顯著降低。而Ad-SLPI-GFP感染72小時(shí)后，熒光顯微鏡下可見大量Hep-2細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的綠色熒光信號(hào)，而HuVEC細(xì)胞仍無綠色熒光。以上結(jié)果表明，SLPI啟動(dòng)子能夠在喉癌細(xì)胞內(nèi)有效下調(diào)EGFR，并特異性調(diào)控綠熒光蛋白在人喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep-2細(xì)胞中表達(dá)，而在正常人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HuVEC中無表達(dá)，72小時(shí)為合適的感染時(shí)間。
　　2.重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對(duì)喉癌細(xì)胞Hep-2的體外抑制作用
　

11、　2.1 重組腺病毒對(duì)細(xì)胞增殖抑制作用的試驗(yàn)MTT結(jié)果顯示，感染72小時(shí)后重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對(duì)堠癌細(xì)胞Hep-2的增殖有較強(qiáng)的抑制作用，在MOI為50pfu/cell時(shí)就能有效地抑制喉癌細(xì)胞的增殖（抑制率為22.5％），但對(duì)正常細(xì)胞HuVEC的增殖卻無明顯抑制作用(抑制率為-4.2％)。
　　2.2 重組腺病毒作用72小時(shí)后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR(MOI=50)作用72小時(shí)

12、后的喉癌細(xì)胞Hep-2在形態(tài)學(xué)上發(fā)生了顯著的變化:細(xì)胞變圓，皺縮，部分呈串珠狀、浮起。而正常細(xì)胞HuVEC在病毒作用前后細(xì)胞形態(tài)差異不明顯。而對(duì)照病毒Ad-SLPI-GFP(MOI=50)作用前后，Hep-2及HuVEC細(xì)胞形態(tài)均無明顯差異。
　　2.3 流式細(xì)胞儀定量分析細(xì)胞凋亡流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR在MOI=35及MOI=50下作用72小時(shí)后，Hep-2細(xì)胞的凋亡率（即Annexin V-

13、R-PE和7-AAD均染色的細(xì)胞）分別為32.8％和31.8％，而Ad-SLI-GFP作用72小時(shí)后相應(yīng)的凋亡率分別為9.2％和10.0％，兩種病毒差異顯著，從定量角度說明重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR能通過有效誘導(dǎo)凋亡而對(duì)喉癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖起抑制作用。而對(duì)于正常臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HuVEC，在MOI=35的Ad-SLPI-EGFRamiR，Ad-SLPI-GFP作用72小時(shí)后的凋亡率分別為11.1％，8.2％，在MOI=50的

14、相應(yīng)病毒作用下凋亡率分別為15.5％，4.8％，差異均不顯著。
　　3.重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR對(duì)喉癌荷瘤模型腫瘤組織生長(zhǎng)的抑制作用
　　3.1 重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR的體內(nèi)抑制腫瘤生長(zhǎng)作用在首次治療后第13天，Ad-SLPI-EGFRamiR治療組的瘤體體積小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組，但是這一差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義(P＞0.05)。與首次治療日的瘤體體積相比，Ad-SL

15、PI-EGFRamiR組的瘤體體積增長(zhǎng)速度小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組，但是仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義(P＞0.05)。在觀察結(jié)束時(shí)（首次給藥后第20天）Ad-SLPI-EGFRamiR組瘤重小于Ad-SLPI-GFP組及吉非替尼組，但這一差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著意義(P＞0.05)。
　　3.2 重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR的體內(nèi)不良反應(yīng)觀察在治療過程中，Ad-SLPI-EGFRamiR組及Ad-SLPI-GF

16、P組裸鼠的身體狀況良好，精神狀態(tài)、活動(dòng)及飲食情況均無明顯異常。但是吉非替尼組的部分小鼠出現(xiàn)精神萎靡、腹瀉、食欲不振情況。Ad-SLPI-EGFRamiR組裸鼠的體重增長(zhǎng)率與Ad-SLPI-GFP組裸鼠相比無明顯差異(P＞0.05)，但是卻明顯高于吉非替尼組(P＜0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.重組腺病毒Ad-SLPI-EGFRamiR和Ad-SLPI-GFP均能有效感染Hep-2細(xì)胞，并表達(dá)相應(yīng)的基因，具有良好的喉癌組