1、誘導多能干細胞（Induced Pluripotent Stem Cells，iPSCs）自誕生以來，由于和胚胎干細胞（Embryonic Stem Cells，ESCs）一樣既有自我更新、無限增殖能力，又有分化形成機體幾乎全部類型細胞的潛能，在再生醫(yī)學、畜禽種質資源保護與創(chuàng)新和生物學基礎研究等方面極具應用價值，因而迅速成為生命科學研究領域中的前沿熱點。如今，人們已成功獲得了包括豬在內的多種家養(yǎng)動物的iPSCs，打破了長期未能獲取豬和其

2、它家畜真正ESCs的窘境。然而，iPSCs仍面臨質量參差不齊、效率低和安全性不確定等突出問題。利用重組蛋白或小分子化合物誘導iPSCs為克服外源基因插入所可能導致的安全隱患奠定了良好基礎。但至今關于重組蛋白誘導豬iPSCs的報道十分有限。本研究將分別構建豬LIN28、KLF4、c-MYC和OCT4四種基因與細胞穿膜肽11R融合表達的原核載體，并重點探討制備豬LIN28-11R可溶性融合重組蛋白的優(yōu)化條件，同時對另三種轉錄因子重組蛋白的表

3、達條件進行初步探索，以期為今后利用這四種重組蛋白誘導獲取豬iPSCs奠定基礎。具體試驗及結果如下：
　　1.豬LIN28、KLF4、c-MYC及OCT4基因原核表達載體的構建及鑒定。首先，用Optimum Gene軟件對豬 OCT4（NP_001106531）、KLF4（NP_001026952）、c-MYC（NP_001005154）、LIN28（NP_001116605）基因序列進行密碼子優(yōu)化，并在目的基因3’端加上編碼Lin

4、ker和穿膜肽11R的基因序列。通過人工合成的方法獲得目的基因，再亞克隆至pET30a載體中。
　　酶切鑒定和測序驗證結果表明，成功構建出pET30a-NdeI-Oct4-linker-11R-XhoI-His、pET30a-NdeI-Lin28-linker-11R-XhoI-His、pET30a-NdeI-Klf4-linker-11R-XhoI-His、pET30a-NdeI-c-Myc-linker-11R-Xho I-H

5、is四種穿膜肽與多能性轉錄因子融合表達的原核載體。
　　2.豬源LIN28-11R重組蛋白制備及其它三種轉錄因子重組蛋白誘導表達條件的初步探索。將重構質粒轉化到大腸桿菌BL21中，在不同的時間和溫度條件下誘導表達，篩選出LIN28-11R重組蛋白的最佳表達條件，并進行大量表達；蛋白產物經純化和鑒定后進行細胞穿膜添加實驗，以驗證其是否具有穿透細胞膜的能力。同時，對另外三種多能性因子重組蛋白的誘導表達條件進行了初步探索。
　　本

6、試驗最終獲得并純化出了可溶性的豬LIN28-11R重組蛋白，該重組蛋白具有穿透細胞膜的能力。而初步研究發(fā)現(xiàn)，OCT4-11R、KLF4-11R和c-MYC-11R三種重組蛋白的最佳誘導表達條件可能是：KLF4-11R在37℃誘導4h時表達量相對較高，并在菌體裂解液上清中表達量較高；c-MYC-11R在37℃誘導4h的條件下有表達，且只在菌體裂解液及裂解液沉淀中表達；OCT4-11R在不同溫度（37℃、30℃）條件下幾乎均未表達。