1、[研究背景及目的]:
　　 肝細(xì)胞癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)是世界上最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤的前列。近年來(lái)，雖然不斷有新的治療手段出現(xiàn)，但晚期肝癌的預(yù)后未能得到根本改變，臨床迫切需要尋找新的治療方案。
　　 肝細(xì)胞核因子4α(HNF4α)是一種細(xì)胞核激素受體家族的轉(zhuǎn)錄因子，在分化成熟的肝細(xì)胞中高表達(dá)，對(duì)肝細(xì)胞分化和維護(hù)肝細(xì)胞生物學(xué)功能發(fā)揮著重要轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。本

2、實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，HNF4α過(guò)表達(dá)腺病毒感染肝癌細(xì)胞株，可使肝癌細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志蛋白(CD90、CD133)下調(diào)，肝功能相關(guān)基因上調(diào)，發(fā)生“肝細(xì)胞樣”改變，肝癌細(xì)胞成瘤能力消失。體內(nèi)研究表明，HNF4α可顯著抑制小鼠實(shí)驗(yàn)性肝癌生長(zhǎng)。
　　 HNF4α作為一種作用廣泛的核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子，能夠被部分miRNA調(diào)控的同時(shí)，也能夠調(diào)控一部分miRNA。新近發(fā)現(xiàn)miR-629、miR-24可靶向負(fù)調(diào)控HNF4α表達(dá)，從而促進(jìn)肝癌發(fā)生，而

3、HNF4α調(diào)控的miR-124可顯著抑制肝癌的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)HNF4α能夠直接結(jié)合于人14號(hào)染色體印記基因Dlk1/Dio3區(qū)域上位點(diǎn)，對(duì)該區(qū)域中hsa-miR-379～hsa-miR-656 miRNA簇進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控，并且過(guò)表達(dá)該區(qū)域上的miRNAs對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲均有不同程度的抑制作用。miR-134是該區(qū)域中一個(gè)miRNAs。
　　 基于以上研究背景和前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，本課題首先分析miR-134在肝

4、癌組織的表達(dá)及其與肝癌患者臨床惡性表型和預(yù)后的相關(guān)性，并探討miR-134對(duì)肝癌細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為肝癌的診治提供新的靶點(diǎn)。
　　 [實(shí)驗(yàn)方法]:
　　 一、miR-134在肝癌組織中的變化及其臨床意義
　　 1.腹腔注射二乙基亞硝胺（diethylinitrosamine，DEN）制備大鼠肝癌模型。分別取正常、11周、14周、17周、19周大鼠肝組織，用Real-time PCR的方法檢測(cè)DEN造模大鼠肝臟組

5、織中HNF4α及miR-134前前體(primary miR-134; pri-miR-134)的表達(dá)，并對(duì)兩者的表達(dá)相關(guān)性進(jìn)行分析。
　　 2.利用Real-time PCR檢測(cè)臨床標(biāo)本中肝癌/癌旁組織中pri-miR-134及HNF4α的差異表達(dá)，分析兩者表達(dá)的相關(guān)性，并從腫瘤大小、肝癌臨床分期、AFP、生存期等方面分析miR-134在肝癌組織中表達(dá)變化的臨床意義。
　　 二、miR-134抑制肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性

6、r>　　 1.利用化學(xué)合成的miR-134擬似物(miR-134 mimic)上調(diào)肝癌細(xì)胞株YY-8103及LM3細(xì)胞中miR-134表達(dá)，或利用2'-甲氧修飾的miR-134互補(bǔ)鏈(as-miR-134)抑制肝癌細(xì)胞株miR-134的作用，通過(guò)CCK8（cell counting kit-8）檢測(cè)miR-134對(duì)肝癌細(xì)胞增殖能力的影響。
　　 2.YY-8103及LM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134 mimic或as-miR-134

7、后，觀察miR-134對(duì)腫瘤細(xì)胞在軟瓊脂培養(yǎng)基中克隆形成能力的影響。
　　 3.YY-8103及LM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134 mimic或as-miR-134后，通過(guò)細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)觀察miR-134對(duì)肝癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　 4.YY-8103細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-134 mimic后，檢測(cè)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡。
　　 5.miR-134對(duì)肝癌細(xì)胞成瘤性的影響
　　 分別將感染表達(dá)miR-134的

8、腺病毒(Ad-miR-134)及對(duì)照病毒(Ad-GFP)的肝癌細(xì)胞YY-8103、LM3接種于裸鼠兩側(cè)腋窩皮下，定期觀察腫瘤生長(zhǎng)情況并測(cè)量大小，觀察miR-134對(duì)肝癌細(xì)胞成瘤性的影響。
　　 6.miR-134對(duì)裸鼠皮下種植瘤生長(zhǎng)的影響
　　 在裸鼠兩側(cè)腋窩皮下注射LM3細(xì)胞，每側(cè)2×106個(gè)細(xì)胞，待腫瘤長(zhǎng)至50 mm3時(shí)（約10天），瘤內(nèi)注射Ad-miR-134或Ad-GFP(2×109 pfu)，每周2次，觀察腫瘤

9、生長(zhǎng)情況并測(cè)量腫瘤大小。3周左右處死裸鼠，取腫瘤組織稱重，測(cè)量大小，抽提組織RNA，Real-time PCR法檢測(cè)兩側(cè)腫瘤中miR-134的差異表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩側(cè)腫瘤中Ki67及靶基因的表達(dá)情況，綜合評(píng)估上調(diào)miR-134表達(dá)對(duì)裸鼠皮下種植瘤模型的治療效果。
　　 三、確定miR-134的靶基因
　　 通過(guò)targetscan預(yù)測(cè)miR-134靶基因，在YY-8103肝癌細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-134 mimic或

10、as-miR-134，通過(guò)Western Blot和Real-time PCR驗(yàn)證miR-134的靶基因。進(jìn)一步利用含有靶基因3'UTR的報(bào)告基因載體證實(shí)miR-134對(duì)其靶基因。共轉(zhuǎn)染不含3'UTR的靶基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及miR-134 mimic檢測(cè)YY-8103的增殖能力、軟瓊脂克隆形成能力、遷移及侵襲能力的變化，確定miR-134是否通過(guò)該靶基因發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)。
　　 四、miR-134在HNF4α抑制肝癌過(guò)程中的作用

11、r>　　 YY-8103細(xì)胞株感染HNF4α病毒上調(diào)HNF4α的同時(shí)，轉(zhuǎn)染as-miR-134下調(diào)miR-134，檢測(cè)肝癌細(xì)胞增殖、軟瓊脂克隆形成能力、遷移及侵襲能力的變化，并利用RT-PCR和Westem Blot檢測(cè)miR-134靶基因mRNA及蛋白水平。
　　 五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　 數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行分析。方差齊性兩樣本資料采用兩樣本雙尾T檢驗(yàn);方差不齊的配對(duì)資料采用Wilcoxon符號(hào)秩檢驗(yàn)

12、;方差不齊的不配對(duì)資料采用Mann-Whitney U檢驗(yàn);四格表資料采用x2檢驗(yàn);生存分析采用Kaplan-Meier分析;生存曲線采用log-rank檢驗(yàn);P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 [實(shí)驗(yàn)結(jié)果]:
　　 一、miR-134在肝癌組織中的變化及其臨床意義
　　 檢測(cè)DEN誘發(fā)的大鼠實(shí)驗(yàn)性肝癌模型不同時(shí)間點(diǎn)肝組織中HNF4α及pri-miR-134的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，肝臟HNF4α及p

13、ri-miR-134表達(dá)下調(diào)，并且HNF4α與pri-miR-134的表達(dá)變化呈線性相關(guān)。
　　 在71例臨床標(biāo)本中，有63％(45/71)肝癌組織中HNF4α表達(dá)較癌旁組織下降，70％(50/71)肝癌組織中pri-miR-134表達(dá)下調(diào)。與HNF4α表達(dá)不下調(diào)的病例相比，在HNF4α表達(dá)下調(diào)的病例中pri-miR-134表達(dá)降低的更多，（HNF4α-high89％:HNF4α-low38％，P＜0.001），而且腫瘤組織pr

14、i-miR-134高表達(dá)的病例較pri-miR-134低表達(dá)的病例，腫瘤更小，合并肝硬化的比率小，處于TNMⅠ-Ⅱ期的比例高，有包膜包裹的病例數(shù)多（x2檢驗(yàn)，P＜0.05）。
　　 二、miR-134抑制肝癌細(xì)胞生物學(xué)特性及其機(jī)制
　　 1.miR-134能夠抑制腫瘤生物學(xué)特性
　　 (1) miR-134抑制人肝癌細(xì)胞株增殖能力
　　 miR-134可降低肝癌細(xì)胞株YY-8103及LM3的增殖能力，而抑

15、制miR-134作用可顯著促進(jìn)肝癌細(xì)胞株的增殖。
　　 (2) miR-134抑制人肝癌細(xì)胞株軟瓊脂克隆形成能力
　　 miR-134可以顯著抑制YY-8103及LM3細(xì)胞的軟瓊脂克隆形成能力，抑制率約為70％;反之，轉(zhuǎn)染as-miR-134后，肝癌細(xì)胞的克隆形成能力相比對(duì)照組明顯增強(qiáng)，最高可達(dá)1.5倍。
　　 (3) miR-134抑制人肝癌細(xì)胞遷移及侵襲能力
　　 YY-8103及LM3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR

16、-134 mimic后，細(xì)胞的遷移及侵襲能力受到抑制;而轉(zhuǎn)染as-miR-134后，肝癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯增強(qiáng)。
　　 (4) miR-134可使YY-8103細(xì)胞周期阻滯在G2/M期
　　 YY-8103中轉(zhuǎn)染miR-134 mimic48小時(shí)后流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，結(jié)果顯示，相比對(duì)照組，miR-134能夠?qū)⒓?xì)胞阻滯在G2/M期（117％，P＜0.01）。同時(shí)，AnnexinV-EGFP/PI雙染檢測(cè)細(xì)胞凋亡，

17、miR-134組與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 (5) miR-134能夠顯著抑制肝癌細(xì)胞的皮下成瘤能力
　　 皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:YY-8103細(xì)胞感染AdGFP/AdmiR-134后接種于裸鼠皮下，18天時(shí)AdGFP組10只(100％)可觸及腫瘤，而18天時(shí)AdmiR-134組只有3只(30％)小鼠可觸及腫瘤生長(zhǎng)，且腫瘤較AdGFP側(cè)小。LM3-AdGFP組接種11天后8只(80％)皮下可觸及腫瘤，19天后10只(1

18、00％)小鼠可觸及腫瘤生長(zhǎng)，然而，AdmiR-134感染的LM3細(xì)胞接種10天后僅1只(10％)出現(xiàn)皮下腫瘤，25天時(shí)6只(60％)觸及皮下腫瘤，且相比AdGFP組，AdmiR-134組腫瘤體積較小。
　　 (6) miR-134抑制肝癌皮下種植瘤生長(zhǎng)
　　 通過(guò)瘤內(nèi)注射AdmiR-134/AdGFP，發(fā)現(xiàn):在每個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)Ad-miR-134注射組腫瘤體積均明顯小于Ad-GFP注射組。處死老鼠后取出腫瘤，Ad-miR-

19、134組腫瘤重量顯著輕于對(duì)照組。Real-time PCR結(jié)果顯示，與對(duì)照側(cè)相比，注射Ad-miR-134的腫瘤miR-134表達(dá)均有不同程度升高，免疫組化結(jié)果顯示AdmiR-134組增殖相關(guān)抗原Ki67陽(yáng)性細(xì)胞比例減少。
　　 2.KRAS是miR-134的直接靶基因
　　 (1)在不同肝癌細(xì)胞株中，miR-134能夠下調(diào)KRAS mRNA及蛋白水平;而as-miR-134能夠上調(diào)KRAS mRNA及蛋白水平;

20、　　 (2)熒光素酶報(bào)告基因提示miR-134能夠下調(diào)KRAS3'UTR報(bào)告基因質(zhì)粒表達(dá)，而突變KRAS3'UTR上結(jié)合位點(diǎn)則無(wú)法下調(diào)熒光素酶表達(dá);
　　 (3)皮下種植瘤注射AdmiR-134組腫瘤相比對(duì)照組腫瘤，KRAS表達(dá)明顯降低。
　　 3.miR-134通過(guò)下調(diào)靶基因發(fā)揮其生物學(xué)功能
　　 過(guò)表達(dá)KRAS能夠減弱miR-134對(duì)YY-8103肝癌細(xì)胞的增殖、軟瓊脂克隆形成能力及細(xì)胞遷移、侵襲能力的抑制

21、作用。
　　 4.HNF4α通過(guò)上調(diào)miR-134逆轉(zhuǎn)腫瘤惡性進(jìn)展
　　 as-miR-134能夠輕微下調(diào)HNF4α對(duì)YY-8103的增殖抑制作用，顯著降低HNF4α對(duì)腫瘤細(xì)胞軟瓊脂克隆形成能力、遷移和侵襲能力的抑制作用。此外，下調(diào)miR-134表達(dá)可抑制HNF4α對(duì)KRAS基因及蛋白表達(dá)的作用。
　　 [結(jié)論]:
　　 1.肝癌組織中miR-134表達(dá)與HNF4α呈顯著正相關(guān)，且與肝癌臨床惡性表型密切相