1、研究背景及目的： 持續(xù)不斷的血糖供應(yīng)是保持腦功能正常的基本要求。由于多種原因使得生后能量代謝適應(yīng)過程發(fā)生異常而使新生兒階段成為人一生中最易發(fā)生低血糖的階段。反復(fù)的、嚴(yán)重的新生兒低血糖可以造成不可逆的腦損傷，導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，但至目前為止我們對反復(fù)、嚴(yán)重的新生期低血糖造成不可逆腦損傷的機(jī)制了解甚少。在臨床實踐中單純研究新生兒低血糖是受限制的，因為低血糖常伴發(fā)在其它疾病中，而且我們尚沒有一個可靠的新生期低血糖腦損傷的動物模型

2、來進(jìn)行深入的研究。因此建立一個可靠的新生期低血糖腦損傷的動物模型是十分必要和迫切的。多年來對成熟腦低血糖損害的研究表明，嚴(yán)重低血糖時，腦組織得不到足夠葡萄糖的供應(yīng)，使腦電活動減少，游離脂肪酸和氨基酸代謝障礙，使谷氨酸的水平增加，低血糖腦損傷是谷氨酸的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮性中毒的最終結(jié)果。 本課題首先建立一個可靠穩(wěn)定的新生期低血糖的動物模型，然后在此動物模型的基礎(chǔ)上探討線粒體功能異常在低血糖導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的機(jī)制中的作用，最后給予低血糖

3、動物額外提供丙酮酸鈉，探討丙酮酸鈉對反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷動物神經(jīng)元及其功能是否具有保護(hù)性，為臨床治療新生兒低血糖，防止低血糖腦損傷后遺癥建立新的思路和提供理論依據(jù)。 研究方法： 1.建立反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷的大鼠模型。實驗采用新生Wistar大鼠，胰島素15 U/kg皮下注射和饑餓的方法誘導(dǎo)低血糖。160只實驗動物隨機(jī)分為胰島素處理S組(insulin-treated rats with short hypo

4、glycemia，INS-S，n=40)、胰島素處理P組(insulin-treated rats with prolonged hypoglycemia，INS-P，n=40)、饑餓組(fasted rats，F(xiàn)AS，n=40)和對照組(control rats，CON，n=40)。INS-S組新生鼠低血糖持續(xù)1.5h，INS-P組新生鼠低血糖持續(xù)2.5h，F(xiàn)AS組新生鼠饑餓12h，處理中用微量血糖儀對新生鼠血糖進(jìn)行檢測。新生鼠低血糖

5、的誘導(dǎo)在生后第二天(postnatal day,P2)、P4和P6進(jìn)行3次，第三次低血糖處理后2h、6h、1d、3d、7d、14d取腦，制作腦組織切片經(jīng)Fluoro-Jade B染色，計數(shù)大腦旁矢狀面皮層、海馬CA1區(qū)(cornu ammonis sector 1，CA1)、CA3、海馬齒狀回(dentate gyrus of hippocampus，DG)、丘腦、下丘腦和梨狀皮層7個區(qū)域變性神經(jīng)元的數(shù)目。并在最后一次低血糖后6h取海馬

6、CA3區(qū)進(jìn)行電鏡檢查。 2.反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷機(jī)制的研究：158只實驗動物隨機(jī)分為INS-P組(n=79)和CON(n=79)組。①線粒體膜電位的檢測：低血糖處理后6h取新鮮大腦皮層制作單個神經(jīng)元的懸液，用羅丹明123(Rhodamine123，Rho123)染色后流式細(xì)胞儀檢測神經(jīng)元懸液Rho 123的熒光強(qiáng)度。②胞漿cyt c水平的檢測：低血糖處理后2h、6h、1h、3h、7h、14h取新鮮大腦皮層組織，低溫差速離心法提取神

7、經(jīng)元的胞漿蛋白，western blot法檢測大腦皮層神經(jīng)元胞漿內(nèi)cyt c的水平。③活化caspase-3的檢測：低血糖處理后2h、6h、1h、3h、7h、14h取腦，用熒光免疫組化的方法檢測caspase-3 P20在細(xì)胞中的表達(dá)，同時應(yīng)用特異性神經(jīng)核抗原(neuronal nuclear protein，NeuN)鑒定細(xì)胞類型，并觀察神經(jīng)元形態(tài)的變化。 3.丙酮酸鈉給藥對反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用：36只實驗

8、動物隨機(jī)分為胰島素處理P組(insulin-treated rats with prolonged hypoglycemia，INS-P，n=12)、胰島素處理+丙酮酸鈉組(insulin-treated rats with prolonged hypoglycemia+pyruvate，INS-PP，n=12)和對照組(control rats，CON，n=12)。在終止實驗動物低血糖的同時給予INS-PP組新生鼠丙酮酸鈉(500mg

9、/kg)。于第三次低血糖處理后1d取腦制作腦組織切片，F(xiàn)luoro-Jade B染色計數(shù)各腦區(qū)變性神經(jīng)元。第三次低血糖處理后六周Morris水迷宮測試大鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。 研究結(jié)論： 1.胰島素(15 U/kg)皮下注射可誘導(dǎo)出新生大鼠低血糖的發(fā)生，且新生大鼠對胰島素的敏感性和耐受性良好，饑餓12h也可誘導(dǎo)出新生大鼠輕度的低血糖。 2.反復(fù)嚴(yán)重的新生期低血糖可造成大鼠明顯的腦損傷，皮層、丘腦、下丘腦、海馬齒狀

10、回是反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖的易損區(qū)。 3.Fluoro-Jade B染色是一種有效的新生鼠低血糖腦損傷神經(jīng)元變性的檢測辦法。 4.反復(fù)嚴(yán)重的新生期低血糖腦損傷中，存在神經(jīng)元線粒體△ψm下降，cyt c釋放，caspase-3激活，神經(jīng)元呈現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)特征，線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡程序在反復(fù)嚴(yán)重的新生鼠低血糖腦損傷發(fā)生機(jī)制中起到一定的作用。 5.丙酮酸鈉對反復(fù)嚴(yán)重新生鼠低血糖時神經(jīng)元及其功能具有明顯的保護(hù)作用。

11、 創(chuàng)新和意義： 1.本研究首次建立反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷的大鼠模型，并應(yīng)用變性神經(jīng)元的特異性熒光染料證實其腦損傷的存在，發(fā)現(xiàn)反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖腦損傷的易損區(qū)，與成熟腦略有不同。 2.研究證實了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡程序在反復(fù)嚴(yán)重新生鼠低血糖腦損傷發(fā)生機(jī)制中起到一定的作用；反復(fù)嚴(yán)重新生鼠低血糖可導(dǎo)致神經(jīng)元的凋亡。 3.研究證明丙酮酸鈉對反復(fù)嚴(yán)重新生鼠低血糖腦損傷神經(jīng)元及其功能具有保護(hù)作用，為反復(fù)嚴(yán)重新生期低血糖