1、目的：通過研究丙酮酸乙酯對(duì)急性肝損傷大鼠腸粘膜緊密連接蛋白ZO-1表達(dá)和肝枯否細(xì)胞炎癥因子釋放以及對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥因子釋放的影響，探討丙酮酸乙酯對(duì)急性肝損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。 材料與方法：第一部分實(shí)驗(yàn)：Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組(腹腔注射等量生理鹽水)、急性肝損傷組(D-GalN/LPS 700mg/5ug/kg腹腔注射)、EP預(yù)防組(于D-GalN/LPS注射前1h，EP40mg/kg腹腔注射)。以上各組于注射

2、造模后48h自腹主動(dòng)脈采血做血漿ALT及內(nèi)毒素水平的檢測(cè)，并留取一段腸組織HE染色觀察并采用免疫組化方法測(cè)定腸粘膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)。第二部分實(shí)驗(yàn)：Wistar大鼠30只，隨機(jī)分為對(duì)照組(腹腔注射等量生理鹽水)、急性肝損傷組(D-GalN/LPS 700mg/5ug/kg腹腔注射)、EP治療組(于注射D-GaIN/LPS后24h，EP40mg/kg腹腔注射)。各組于注射造模后48h腹主動(dòng)脈取血，分別用自動(dòng)生化儀測(cè)血漿AL

3、T含量、ELISA方法檢測(cè)血漿TNF-α含量、Western blot療法檢測(cè)血漿HMGB1含量。第三部分實(shí)驗(yàn)：1、新生兒臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外原代培養(yǎng)與鑒定：將新生兒臍靜脈通過酶消化法使內(nèi)皮細(xì)胞脫落，進(jìn)行原代培養(yǎng)并采用免疫組化方法對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞vWF因子進(jìn)行鑒定。2、細(xì)胞免疫組化實(shí)驗(yàn)分為三組：對(duì)照組、LPS刺激組、EP組，采用免疫組化方法檢測(cè)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HMGB1、ICAM-1的表達(dá)；3、HMGB1在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌的時(shí)間規(guī)律以及丙酮酸

4、乙酯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌HMGB1的作用：細(xì)胞分三組，對(duì)照組、LPS刺激組(LPS100ng/ml)與EP組(LPS100ng/ml+EP10mM)，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，設(shè)0h、6h、12h、24h、48h五個(gè)時(shí)間點(diǎn)。采用Western blot方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液HMGB1的含量。4、不同劑量的EP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌HMGB1的作用。細(xì)胞分三組(EPOuM組、5uM組、10uM組)，采用Western blot方法檢測(cè)培養(yǎng)上清液HM

5、GB1的含量。 結(jié)果：第一部分實(shí)驗(yàn)：急性肝損傷組ALT、Endotoxin含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，丙酮酸乙酯預(yù)防組ALT、Endotoxin含量仍高于正常對(duì)照組，但顯著低于急性肝損傷組(P<0.05)。病理組織HE染色觀察可見對(duì)照組大鼠腸粘膜表面絨毛排列整齊、柱狀上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整；肝損傷組大鼠腸粘膜表現(xiàn)為間質(zhì)充血水腫，絨毛頂端下間隙增寬，絨毛脫落壞死；EP預(yù)防組改變較損傷組減輕。免疫組化結(jié)果可見ZO-1正常時(shí)均勻

6、一致地分布于小腸上皮細(xì)胞連接處的尖端；肝損傷組ZO-1分布不均、染色變淡，EP預(yù)防組介于二者之間。第二部分實(shí)驗(yàn)：急性肝損傷組ALT、TNF-α含量顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)，丙酮酸乙酯治療組ALT、TNF-α含量仍高于正常對(duì)照組，但顯著低于急性肝損傷組(P<0.01)。各時(shí)間點(diǎn)血漿HMGB1含量變化Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠血漿中未檢測(cè)到HMGB1；ALI組HMGB1含量為171.75±18.80ng/ml

7、；EP組HMGB1含量為78.79±8.55ng/ml。EP組HMGB1含量顯著低于ALI組(p<0.01)。第三部分實(shí)驗(yàn)：原代培養(yǎng)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞vWF因子經(jīng)免疫組化檢測(cè)證實(shí)原代及傳代培養(yǎng)的細(xì)胞為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1、HMGB1表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示：未刺激時(shí)HMGB1聚集在細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞核呈棕色深染；LPS組刺激后HMGB1從細(xì)胞核釋放，胞漿染色加深；EP組HMGB1釋放被部分抑制，胞漿染色變淺。未刺激時(shí)細(xì)胞膜、

8、胞漿表面ICAM-1微弱表達(dá)：LPS組ICAM-1在胞膜及胞漿中的表達(dá)呈強(qiáng)陽性，胞漿呈深棕色染色；EP組ICAM-1在胞膜及胞漿中的表達(dá)明顯減弱。培養(yǎng)上清液中HMGB1含量變化檢測(cè)：LPS組上清液HMGB1含量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長明顯增高，呈時(shí)間依賴方式，24h達(dá)分泌高峰；EP組上清液HMGB1含量變化趨勢(shì)與LPS組一致，但HMGB1含量明顯降低(p<0.05)。不同劑量的EP對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分泌GMGB1的作用結(jié)果顯示各細(xì)胞組于LPS10

9、0ng/ml刺激16h后，EP5uM劑量組對(duì)HMGB1分泌具有一定的抑制作用，與EP0uM組比，HMGB1含量明顯降低(p<0.05)；10uM劑量組與0uM組比p<0.01：而且10uM劑量組與5uM劑量組比p<0.05，具有顯著差異。 結(jié)論： 1、丙酮酸乙酯可以增加急性肝損傷時(shí)腸粘膜上皮細(xì)胞緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，可以阻止腸源性內(nèi)毒素血癥的發(fā)生。 2、丙酮酸乙酯可以抑制急性肝損傷時(shí)枯否細(xì)胞釋放TNF-α、