1、背景：植入電子起搏器已成為治療癥狀性緩慢性心律失常的首選方法，并取得很大的成功。然而，有限的電池壽命、缺乏對神經(jīng)激素自動反應性、兒童期植入起搏器后電極不能隨身體的發(fā)育而相應變長等缺點使得人們迫切需要一種更理想的治療方法。國內(nèi)外的學者研究認為利用基因治療和細胞治療構建生物起搏在不久的將來可能會成為電子起搏器最為理想的替代方法。然而目前有關生物起搏的體內(nèi)實驗都沒有超過2周，這是否與目前研究者所選用的基因以及基因載體有關?慢病毒表達系統(tǒng)因其基

2、因組可以整合于宿主基因組中，長時間、穩(wěn)定表達外源基因并具有較低的免疫原性，受到廣泛關注。所以本實驗使用5-aza(5-氮胞苷)誘導骨髓干細胞向心肌樣細胞轉化，同時將HCN4(超極化激活環(huán)核苷酸門控)起搏基因使用慢病毒轉染進心肌樣骨髓基質(zhì)干細胞，觀察在體外能否構建生物起搏細胞，并能長期表達，從而為進一步在體研究生物起搏打下基礎。 第一部分豬骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的分離、培養(yǎng)及5-aza誘導其轉化為心肌樣細胞的研究 第

3、一節(jié)豬骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)的分離、培養(yǎng) 目的：建立豬骨髓間充質(zhì)干細胞體外培養(yǎng)方法，為5-aza誘導轉化為心肌樣細胞提供材料。 方法：豬的骨髓MSCs分離純化后，流式細胞儀檢測細胞周期。 結果：體外培養(yǎng)的原代MSCs10～14d達到融合，細胞周期顯示73％的細胞處于G0/G1期。 結論：根據(jù)黏附特性分離的豬骨髓MSCs在體外條件下可生長擴增，可用于5-aza誘導轉化為心肌樣細胞。 第二節(jié)5-

4、aza體外誘導MSCs分化為心肌樣細胞的研究 目的：建立豬骨髓間充質(zhì)干細胞體外轉化為心肌樣細胞的方法，為構建生物起搏細胞提供新材料。 方法：豬的骨髓MSCs分離純化后，用5-aza誘導后，用抗結蛋白(desmin)、肌球蛋白重鏈(MHC)、心肌特異性肌鈣蛋白I(cTnI)、連接蛋白-43(Cx-43)進行免疫細胞化學染色鑒定。 結果：體外培養(yǎng)的第二代MSCs經(jīng)5-aza誘導后，部分MSCs呈梭形，陽性表達desm

5、in、MHC、cTnI和Cx-43。 結論：根據(jù)黏附特性分離的豬骨髓MSCs在體外條件下可分化為心肌樣細胞，可用于構建生物起搏細胞。 第二部分穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4的構建及HCN4重組慢病毒的包裝 第一節(jié)穿梭質(zhì)粒pCDH1-GFP-HCN4的構建 目的：將全長約3．6kb的hHCN4目的基因片段從Dr Stieber教授惠贈的pCDNA3-hHCN4質(zhì)粒卸載下來，最終裝載到帶有GFP綠色熒光

6、蛋白標記的去內(nèi)毒素穿梭質(zhì)粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上。 方法：用Eco RI和Xba I從pCDNA3-hHCN4質(zhì)粒切下hHCN4目的片段連接到Puc19載體中，再用Eco砒和Hind III從質(zhì)粒Puc19切下目的片段連接到pcDNA3．1(A)載體中，再用Xba I單酶從質(zhì)粒pcDNA3．1(A)雙切到pCDH1-MCS1-EF1-copGFP中。用Xba I或者Eco RI鑒定，將陽性克隆質(zhì)粒送上海生工

7、測序，并將構建的目的基因質(zhì)粒轉染293細胞和豬骨髓間充質(zhì)干細胞。 結果：Xba I及Eco RI鑒定表明，PCR的產(chǎn)物和克隆擴增的產(chǎn)物的電泳結果該基因的大小約為3．6kb；陽性克隆質(zhì)粒測序結果與GENEBANK目的基因HCN4序列完全相同；構建的目的基因質(zhì)粒轉染293細胞和原代的豬骨髓間充質(zhì)干細胞后，均發(fā)現(xiàn)有強烈的綠色熒光的出現(xiàn)。 結論：成功將全長hHCN4目的基因片段從pCDNA3-hHCN4質(zhì)粒卸載下來，裝載到去內(nèi)毒

8、素穿梭質(zhì)粒pCDH1-MCS1-EF1-copGFP上，可用于下一步慢病毒的包裝。 第二節(jié) HCN4重組慢病毒的包裝 目的：使用慢病毒包裝系統(tǒng)(pPACKH1-Lentivector Packaging Kit)建立穩(wěn)定的HCN4重組慢病毒。 方法：實驗過程參照SBI的Lentivector Expression System的操作手冊進行。將構建好的慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔锘旌虾蟾腥?93T細胞及心肌樣骨髓基質(zhì)干細

9、胞。 結果：構建的慢病毒包裝質(zhì)?；旌衔镛D染293細胞和心肌樣豬骨髓間充質(zhì)干細胞后，均發(fā)現(xiàn)有強烈的綠色熒光的出現(xiàn)，細胞感染效率可以達到90％以上。 結論：成功建立穩(wěn)定的hHCN4重組慢病毒，該病毒載體有很高的轉染效率。 第三部分慢病毒轉染基質(zhì)干細胞構建起搏樣細胞的體外研究 目的：使用hHCN4重組慢病毒載體轉染心肌樣骨髓基質(zhì)干細胞獲得穩(wěn)定過表達HCN4基因的起搏樣干細胞。 方法：慢病毒轉染心肌樣骨髓

10、基質(zhì)干細胞實驗過程參照SBI的LentivectorExpression System的操作手冊進行；穩(wěn)定轉染細胞繼續(xù)培養(yǎng)兩周后行Western blot鑒定蛋白的表達并行real-time RT-PCR實時熒光定量檢測HCN4目的基因的表達情況；全細胞膜片鉗記錄轉染細胞HCN4通道電流的表達；轉染細胞體外長期培養(yǎng)觀察細胞的轉染狀態(tài)。 結果：病毒感染48小時后，目的細胞出現(xiàn)大量的熒光；Western blot檢測結果見圖，可見一

11、約170kDa條帶，與克隆hHCN4通道蛋白分子量相符；RT-PCR顯示慢病毒轉染的細胞hHCN4-RNA是原代細胞的123倍；膜片鉗記錄在轉染細胞中可記錄到明顯的電壓與時間依賴性的超極化內(nèi)向電流，即If電流；將轉染的心肌樣骨髓基質(zhì)干細胞培養(yǎng)至2個月時，顯微鏡下發(fā)現(xiàn)細胞呈群體性搏動，20℃室溫下的搏動頻率為15±1次/分。該病毒載體有很高的轉染效率，在體外已獲得至少8個月的陽性表達，8個月后因為細胞污染未進一步觀察。 結論：hH

12、CN4重組慢病毒轉染心肌樣骨髓基質(zhì)干細胞獲得了穩(wěn)定過表達HCN4基因的起搏樣干細胞。這種基因修飾后的心肌樣干細胞有可能成為一種有效的生物起搏種子細胞，并期待在緩慢性心律失常的治療技術上實現(xiàn)新突破。 第四部分穩(wěn)定轉染hHCN4起搏通道亞型的電生理特點 目的：全細胞膜片鉗技術記錄穩(wěn)定轉染pCDH1-GFP-HCN4的心肌樣骨髓基質(zhì)干細胞，了解hHCN4起搏通道亞型的電生理特點。 方法：全細胞膜片鉗技術記錄穩(wěn)定轉染pC

13、DH1-GFP-HCN4的心肌樣骨髓基質(zhì)干細胞，觀察hHCN4通道電流、通道電流激活曲線及電壓依賴性激活時間常數(shù)動力學曲線；改變細胞外液K+、Na+濃度，觀察K+、Na+對IhHCN4電流的影響；以河豚毒素(TTX，INa阻斷劑)、四乙胺(TEA，IK阻斷劑)、環(huán)磷酸腺苷(cAMP)、異丙基腎上腺素(ISO)、乙酰膽堿(Ach)、銫(Cs+)、ZD7288(If電流特異性阻斷劑)和胺碘酮分別灌流，觀察它們對IhHCN4電流的影響。

14、 結果： 1．大多數(shù)穩(wěn)定轉染的心肌樣骨髓干細胞可記錄到約-80mV開始激活的一系列超極化內(nèi)向離子流(I hHCN4電流)，該電流激活緩慢，呈電壓、時間依賴性。電流的激活電位(Vth)、半最大激活電位(V1/2)分別為-83±8mV、-108±2mV，斜率為-11．2±0．6 mV(n=10)。鉗制電壓-140mV時，激活時間常數(shù)為0．66±0．1s：鉗制電壓-110mV時，激活時間常數(shù)為3．1±0．7s。IhHCN4的反轉電位

15、21．2±2．3mV(n=10)，PNa/PK為0．23。 2．鉗制電位-140mV，外液K+濃度30 mmol/L，Na+濃度由110 mmol/L降為50mmol/L，IhHCN4電流密度分別為-300±25pA/pF-1、-87±10 pA/pF-1，減少73％；外液Na+濃度110 mmol/L，K+濃度由30 mmol/L降為5 mmol/L，IhHCN4電流密度分別為-302±30 pA/pF-1、-244±19 p

16、A/pF-1，減少20％。 3．TTX和TEA灌流10min，對IhHCN4沒有影響。 4．1mmol/L cAMP灌流10min，IhHCN4無明顯變化，電極內(nèi)液中加入終濃度為1mmol/L的cAMP，IhHCN4激活加快，激活時間加快，V1/2由-109±2mV變?yōu)?92±2mV，向正向移動17mV，激活閾值及最大激活電流沒有明顯改變 5．1μmol/L ISO灌流10min，IhHCN4略加快。1μmol/

17、L Ach灌流10min，IhHCN4無明顯改變。 6．低濃度Cs+可阻滯IhHCN4，沖洗后抑制作用完全恢復，半效抑制濃度(IC50)為128．8±28．1μmol/L；較低濃度ZD7288可阻滯IhHCN4，沖洗后抑制作用不能恢復，IC50為23．8±5．7μmol/L。 7．胺碘酮可阻滯IhHCN4，沖洗后抑制作用無明顯恢復，IC50為1．34±0．33μmol/L；胺碘酮使各鉗制電壓下IhHCN4激活緩慢。