1、目的:
　　本研究擬采用雙基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將Shox2與HCN4雙基因共同轉(zhuǎn)染至犬MSCs，并行脈沖微電流刺激(electric pulse current stimulation，EPCS)模擬體內(nèi)微電環(huán)境，在體外進(jìn)行誘導(dǎo)分化培養(yǎng)，以獲得具有心臟起搏細(xì)胞特性的起搏樣細(xì)胞，為在體心臟生物起搏研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　研究方法:
　　1.參照本實(shí)驗(yàn)室前期建立的方法進(jìn)行犬MSCs分離、培養(yǎng)與鑒定，而后進(jìn)行MSCs純化及擴(kuò)增，倒

2、置顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征。
　　2.慢病毒載體構(gòu)建:分別構(gòu)建攜帶HCN4+GFP、Shox2+RFP基因及僅含RFP的慢病毒載體，獲得pLentis-HCN4-GFP、pLentis-Shox2-RFP及pLentis-RFP。病毒載體內(nèi)攜帶嘌呤霉素抗藥基因可用于細(xì)胞純化。
　　3.將已構(gòu)建好的慢病毒載體分別轉(zhuǎn)染至第3代生長良好的cMSCs，獲得以下四組。
　　①HCN4組:轉(zhuǎn)染pLentis-HCN4-GF

3、P。
　?、赟hox2組:轉(zhuǎn)染pLentis-Shox2-RFP。
　　③Shox2-HCN4組:共轉(zhuǎn)染pLentis-Shox2-RFP和pLentis-HCN4-GFP。
　?、軐φ战M（RFP組）:只轉(zhuǎn)染pLentis-RFP。
　　轉(zhuǎn)染前行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定慢病毒的最佳細(xì)胞轉(zhuǎn)染密度、最佳轉(zhuǎn)染體系、共轉(zhuǎn)染的最佳轉(zhuǎn)染體系，必要時(shí)可用嘌呤霉素篩選純化轉(zhuǎn)染陽性的細(xì)胞。各組細(xì)胞分別進(jìn)行體外擴(kuò)增培養(yǎng)。
　　4.對經(jīng)誘導(dǎo)分

4、化培養(yǎng)后的各組細(xì)胞進(jìn)行檢測
　?、偌?xì)胞形態(tài)學(xué)檢測:光學(xué)顯微鏡下觀察各組細(xì)胞大小及形態(tài)結(jié)構(gòu)特征;透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞間連接特征。
　?、诿庖邿晒鈾z測各組細(xì)胞Shox2、HCN4、Cx43、Cx45、cTnT蛋白表達(dá)。
　?、鄯謩e用定量RT-PCR(qRT-PCR)、Western blotting方法檢測相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)情況，如:Shox2、Nkx2.5、Tbx3、HCN4、Cx43、Cx45等。

5、r>　　④細(xì)胞電生理學(xué)檢測:選擇培養(yǎng)至5-7天的細(xì)胞，用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測各組細(xì)胞膜電流If表達(dá)情況。
　　5.EPCS誘導(dǎo)經(jīng)Shox2、HCN4基因修飾的cMSCs分化為心臟起搏樣細(xì)胞
　　(1)實(shí)驗(yàn)分組
　?、倩蜣D(zhuǎn)染組:又分為HCN4組、Shox2組、Shox2-HCN4組、RFP組（對照組）。
　?、诨蜣D(zhuǎn)染+EPCS誘導(dǎo)組:又分為HCN4+EPCS組、Shox2+EPCS組、Shox2-HCN4+EP

6、CS組、RFP+EPCS組。
　　(2)體外誘導(dǎo)培養(yǎng)與檢測
　?、賹⒒蜣D(zhuǎn)染+EPCS誘導(dǎo)組細(xì)胞傳代到60 mm的培養(yǎng)皿中，鉑金絲為電極導(dǎo)絲。
　?、谠诩?xì)胞種植后第二天即開始行EPCS，每天刺激3-6 h，刺激5天直到細(xì)胞達(dá)到95％增殖，中途換液1次。所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。
　　③取EPCS刺激第5天的轉(zhuǎn)染+EPCS誘導(dǎo)組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞為同一代數(shù)培養(yǎng)第5天的細(xì)胞進(jìn)行檢測，檢測方法與內(nèi)容同方法4。
　　結(jié)果:

7、
　　1.犬MSCs的分離、培養(yǎng)
　　采用全細(xì)胞貼壁篩選分離法培養(yǎng)cMSCs，原代細(xì)胞48 h首次換液后，貼壁細(xì)胞呈類圓形、多角形、短梭形，細(xì)胞生長緩慢。5～7天后貼壁細(xì)胞分裂增殖加快，相鄰細(xì)胞之間逐漸匯合，可見集落形成，10～14天細(xì)胞生長融合可達(dá)80％，呈渦旋狀或放射狀分布排列。傳代培養(yǎng)后cMSCs貼壁速度比原代細(xì)胞快，呈均勻分布生長。隨著細(xì)胞換液和傳代，貼壁細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于一致;傳代至第3代時(shí)可得到純化的呈典型多邊形或

8、長梭形的細(xì)胞，胞體飽滿，折光性好，具有良好的增殖能力。
　　2.慢病毒載體介導(dǎo)Shox2、HCN4雙基因轉(zhuǎn)染犬MSCs
　　(1)轉(zhuǎn)染效率的比較
　?、賳为?dú)轉(zhuǎn)染pLentis-Shox2-RFP、pLentis-HCN4-GFP:以1.0×104 cells/cm2的密度傳代，在次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到50～60％匯合;慢病毒轉(zhuǎn)染復(fù)數(shù)MOI=20，聯(lián)合助轉(zhuǎn)染劑polybrene2ug/ml，轉(zhuǎn)染時(shí)間24 h，該條件下行轉(zhuǎn)染可

9、取得良好的效果。細(xì)胞轉(zhuǎn)染后72～96 h，HCN4組細(xì)胞可在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光蛋白GFP的表達(dá);Shox2組細(xì)胞可觀察到紅色熒光蛋白R(shí)FP的表達(dá)，兩組細(xì)胞隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，熒光蛋白表達(dá)呈增多、增強(qiáng)的趨勢。在MOI=20時(shí)，HCN4組和Shox2組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為92±3.7％和94±2.5％（n=5），與對照組RFP組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率相當(dāng)（96±3.5％）。說明此兩實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率良好。
　?、诠厕D(zhuǎn)染pLentis-

10、Shox2-RFP和pLentis-HCN4-GFP:以1.0×104 cells/cm2的密度傳代，在次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到50～60％，給予先轉(zhuǎn)染Shox2(MOI=20，polybrene2ug/ml);24h后棄去廢液，重新加入慢病毒HCN4(MOI=27，polybrene2ug/ml)。結(jié)果發(fā)現(xiàn):聯(lián)合HCN4共轉(zhuǎn)染72 h后，Shox2-HCN4組細(xì)胞可在熒光顯微鏡下觀察到紅綠兩種熒光蛋白混合表達(dá)（偏紅色、偏綠色、混合橙色），激

11、光共聚焦顯微鏡下計(jì)數(shù)Shox2-HCN4共轉(zhuǎn)染細(xì)胞的比例為85±2.3％(n=5），共轉(zhuǎn)染效率較高。
　　(2)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化
　　轉(zhuǎn)染慢病毒后，HCN4組、Shox2組和Shox2-HCN4組細(xì)胞較對照組細(xì)胞生長變慢，其中Shox2-HCN4組細(xì)胞生長更慢。三組細(xì)胞形狀也發(fā)生了巨大的變化，顯微鏡下可見少數(shù)細(xì)胞呈分叉和長棒形。
　　(3)免疫熒光結(jié)果分析
　　免疫熒光結(jié)果顯示，HCN4組細(xì)胞可見HCN4蛋白表達(dá);

12、Shox2組和Shox2-HCN4組細(xì)胞除能表達(dá)Shox2蛋白外，還可見HCN4及心肌特異性標(biāo)志物eTnT表達(dá)，其中以Shox2-HCN4組表達(dá)更顯著。
　　(4)分子生物學(xué)檢測
　　選擇培養(yǎng)5-7天的各組細(xì)胞，PCR和Western blotting結(jié)果顯示:
　?、貶CN4、Tbx3和Cx45:與僅轉(zhuǎn)染RFP的對照組比較，Shox2組中HCN4、Tbx3和Cx45的mRNA和蛋白表達(dá)均增加;Shox2-HCN4組T

13、bx3和Cx45增加較Shox2組更顯著;HCN4組中可見Cx45的表達(dá)。
　?、贜kx2.5及Cx43:與僅轉(zhuǎn)染RFP的對照組比較，Shox2組Nkx2.5、Cx43的mRNA和蛋白表達(dá)均下降;Shox2-HCN4組Nkx2.5、Cx43mRNA和蛋白表達(dá)下降更為顯著;HCN4組細(xì)胞中可見Cx43的表達(dá)。
　　結(jié)論:
　　1.應(yīng)用慢病毒載體pLentis-Shox2-RFP和pLenfis-HCN4-GFP成功將Sh

14、ox2-HCN4雙基因共同轉(zhuǎn)染入cMSCs。
　　2.cMSCs轉(zhuǎn)染Shox2后，能夠促進(jìn)cMSCs向心臟起搏樣細(xì)胞分化?？捎^察到心肌特異性標(biāo)志物cTnT，在基因和蛋白水平表達(dá)起搏細(xì)胞標(biāo)志物HCN4，Tbx3和Cx45，而抑制心肌工作細(xì)胞標(biāo)志物Nkx2.5及Cx43的表達(dá)，并能產(chǎn)生功能性If起搏電流，具有心臟發(fā)育早期的起搏樣細(xì)胞特點(diǎn)。
　　3.EPCS作為誘導(dǎo)干預(yù)手段能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)染Shox2的cMSCs向起搏樣細(xì)胞分化，使If