1、關(guān)節(jié)軟骨缺損是一種常見的損傷，由于軟骨的自我修復(fù)能力極弱，一旦受損將導(dǎo)致壞死，發(fā)生骨性關(guān)節(jié)炎。胰島素樣生長因-1(IGF-1)是在軟骨發(fā)育和軟骨自穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)中最重要的生長因子之一，IGF-1能刺激軟骨細胞分裂增殖，并促進軟骨細胞合成Ⅱ型膠原和蛋白聚糖來維持軟骨細胞表型，故其可能作為軟骨缺損治療的有效藥物。骨髓間充質(zhì)干細胞(MSCs)具有以下特點：①易于獲取，來源穩(wěn)定，可來源于自體和異體成人骨髓穿刺，從成人的脂肪和滑膜中也可獲??；②傳代能力

2、強，表型穩(wěn)定；③多向分化，在體內(nèi)不同微環(huán)境和不同誘導(dǎo)因子的作用下可分化成為軟骨、骨骼、神經(jīng)、肌腱和肌肉組織等。近來在諸多領(lǐng)域，尤其是作為組織工程的種子細胞受到重視，若將轉(zhuǎn)基因技術(shù)與干細胞技術(shù)相結(jié)合構(gòu)建新型種子細胞無疑非常具有意義。 材料和方法: 一、實驗動物 日本大耳白兔4只，雌雄不限，月齡1個月，體重0.5-1.0kg，由中國醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。 二、實驗方法 (1)兔骨髓間充質(zhì)干細胞的分

3、離培養(yǎng)及生物學(xué)活性觀察 ①兔骨髓間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng)用密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合，分離、純化兔骨髓間充質(zhì)干細胞，進行體外培養(yǎng)擴增。 ②流式細胞儀檢測取P<,1>代細胞，用流式細胞儀進行分析、鑒定。 ③生物學(xué)性狀的觀察用倒置顯微鏡每日觀察細胞的生長情況并拍照。繪制P<,1>、P<,3>、P<,5>代細胞生長曲線。 (2)胰島素樣生長因子-1及綠色熒光蛋白雙載體的構(gòu)建 ①質(zhì)粒pcDNA3.1-IG

4、F-1的擴增及純化。 ②pcDNA3.1-IGF-1質(zhì)粒的鑒定。 ③構(gòu)建pcGI重組質(zhì)粒。 ④pcGI重組質(zhì)粒的鑒定。 (3)胰島素樣生長因子-1基因修飾對骨髓間充質(zhì)干細胞向軟骨細胞分化的影響 ①脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因轉(zhuǎn)染MSCs及鑒定。 ②觀察轉(zhuǎn)染后的MSCs，計算轉(zhuǎn)染效率。 ③Western blot檢測IGF-1、ColⅡ蛋白表達，采用SPSS10.0統(tǒng)計分析軟件對所得比值

5、進行方差分析。 實驗結(jié)果: 一、兔MSCs的分離、培養(yǎng)和傳代成功 1、細胞懸液接種于塑料培養(yǎng)瓶后，細胞大多為圓形單核細胞，散在均勻分布，接種第7天，細胞貼壁融合率達80％-85％，部分融合成片狀，呈旋渦狀生長。傳代后的細胞生長速度加快，大多于傳代后12小時內(nèi)貼壁、伸展，為長梭形細胞，生長潛伏期較短，7-10天后長滿瓶底，增殖生長迅速。各代細胞形態(tài)基本一致，都為長梭形。 2、經(jīng)流式細胞儀檢測，培養(yǎng)細胞表面標(biāo)

6、志CD29和CD44表達陽性，CD14和CD45表達陰性。 3、繪制P<,1>、P<,3>、P<,5>代次細胞生長曲線后，通過分析可以看出，隨著傳代次數(shù)的增加，細胞的增殖能力變化不大。 二、成功構(gòu)建了含有GFP和IGF-1基因的真核表達載體 1、質(zhì)粒pcDNA3.1-IGF-1的擴增及純化成功。 2、真核表達載體的酶切鑒定證實pcDNA3.1-IGF-1內(nèi)含有IGF-1cDNA片段。 3、ocDN

7、A3.1-IGF-1內(nèi)插入的IGF-1 cDNA片段序列與文獻報道的結(jié)果一致。 4、pcGI真核表達載體的酶切鑒定表明所構(gòu)建的質(zhì)粒方向及大小正確。 三、經(jīng)IGF-1基因修飾的MSCs能夠穩(wěn)定表達Ⅱ型膠原蛋白 1、脂質(zhì)體介導(dǎo)IGF-1基因轉(zhuǎn)染MSCs后，熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染成功的細胞可激發(fā)出綠色熒光。 2、轉(zhuǎn)染后24小時基因轉(zhuǎn)染效率約為(30±2.5)％。 3、Western blot測定IGF-

8、1表達和Ⅱ型膠原(Collagen Ⅱ)蛋白表達凈灰度值轉(zhuǎn)染組明顯高于空載體組和未轉(zhuǎn)染組。 結(jié)論: 1、密度梯度離心法與貼壁培養(yǎng)篩選法相結(jié)合體外培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細胞，可以提高干細胞分離純化效率，使體外培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力增強，從而進一步證明了骨髓間充質(zhì)干細胞可以作為組織工程中理想的種子細胞。 2、成功構(gòu)建了含有GFP和IGF-1基因的真核表達載體。 3、經(jīng)IGF-1基因修飾的MSCs表達IGF