1、研究背景與目的：病態(tài)竇房結綜合征(簡稱病竇綜合征)臨床常見，對人體健康危害極大，且發(fā)病機理不清，也無有效防治措施。目前，病竇綜合征的治療以植入電子心臟起搏器為首選，但電子心臟起搏器價格昂貴、電池壽命有限、需要定期檢測及更換，以及植入電子心臟起搏器可發(fā)生一些難以避免的并發(fā)癥，使其應用受限。因此，探討對病竇綜合征患者竇房結結構與功能進行修復，重建一個具有正常生理功能的“生物心臟起搏器”，以取代電子心臟起搏器治療，則是當今心臟電生理學界研究的

2、熱點之一。近年來，雖有少數將骨髓間充質干細胞(MSCs)直接或修飾后移植至生物體內以構建心臟起搏點的研究，但其結果尚不十分令人滿意，其主要問題是移植細胞在體內存活時間短、心率增快不明顯及心率變異性低等，表明現(xiàn)有的“種子細胞”尚不能滿足構建“生物心臟起搏器”的需要。因此，探索尋找適合構建生物心臟起搏器的“種子細胞”，已成為當前心臟電生理學研究的重點內容之一。 既往研究表明，起搏電流(funny current，I<,f>)是心臟竇

3、房結細胞自律性產生與維持的決定因素，而超極化激活的環(huán)化核苷酸門控通道(HCN)基因家族則是I<,f>形成的分子基礎。HCN基因家族包括四個成員，即HCN1～HCN4，其中HCN4與I<,f>的形成關系最為密切。為探討mHCN4基因修飾的大鼠MSCs作為構建生物心臟起搏器“種子細胞”的可行性，本研究在國家自然科學基金(30370585)的資助下，利用本課題組在前期研究中構建的mHCN4基因逆轉錄病毒載體，對大鼠MSCs進行轉染，并在體外誘

4、導培養(yǎng)，以期獲得具有自律性的心臟起搏樣細胞，為構建生物心臟起搏器提供“種子細胞”。 研究方法： 1．以mHCN4逆轉錄病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)及不含mHCN4的逆轉錄病毒對照載體(pMSCV-EGFP)分別轉染大鼠MSCs，并進行嘌呤霉素加壓篩選，觀察綠熒光蛋白表達情況，并以免疫細胞化學檢測mHCN4基因表達，以全細胞膜片鉗技術對重組mHCN4通道進行動力學測定。 2．將獲得的mHCN4基因修

5、飾大鼠MSCs進行體外誘導培養(yǎng)，用倒置顯微鏡進行活細胞形態(tài)學的動態(tài)觀察。 3．用透射電鏡觀察誘導培養(yǎng)后細胞的超微結構，用免疫細胞化學法檢測細胞α-actin、cTnT及Cx43的表達，用膜片鉗技術記錄細胞的動作電位。 4．對轉染mHCN4基因的大鼠MSCs與分離的普通心房肌細胞進行混合培養(yǎng)，用透射鏡電觀察細胞間結構連接情況；用熒光光漂白后恢復技術(FRAP)檢測細胞間通訊功能狀況。 研究結果： 1．成功將

6、mHCN4逆轉錄病毒載體(pMSCV-mHCN4-EGFP)轉染至大鼠MSCs，并經加壓篩選獲得了穩(wěn)定表達mHCN4基因的大鼠MSCs。 2．對獲得的穩(wěn)定表達mHCN4基因的大鼠MSCs進行細胞膜片鉗檢測，可記錄到超極化激活的內向電流，其半數最大激活電壓為-98.2±5.7mV，反轉電位是22.5±5.2mV，在-140mV指令電位時的激活時間常數為451±61ms。該電流具有明顯的時間及電壓依賴特性，且對細胞外Cs<'+>高度

7、敏感。在相同記錄條件下，僅轉染pMSCV-EGFP的大鼠MSCs及未轉染組大鼠MSCs均未記錄到明確的超極化內向電流。 3．對mHCN4基因修飾的大鼠MSCs進行誘導培養(yǎng)，用倒置顯微鏡進行活細胞觀察發(fā)現(xiàn)，普通培養(yǎng)10天左右，可觀察到搏動細胞出現(xiàn)，細胞呈長桿狀，搏動頻率88-318次不等，平均202±72.9次/分，單個細胞自主搏動2-3天后停止，其收縮最明顯地部位出現(xiàn)空泡狀結構。隨后搏動細胞不斷出現(xiàn)，呈集落生長，可觀察到短梭形、

8、單細胞核細胞搏動。GFP組細胞僅見少量長桿狀細胞出現(xiàn)，未觀察到細胞自主搏動，對照組細胞形態(tài)未見明顯變化及細胞的自主搏動。 4．選擇普通培養(yǎng)14天的搏動細胞，用全細胞膜片鉗技術檢測發(fā)現(xiàn)，該細胞可記錄到竇房結細胞樣的動作電位(平均最大舒張電位為-50.9±4.8mV，平均動作電位幅度為62.9±5.2mV)； 5．搏動細胞經免疫細胞化學檢測，該細胞不但表達mHCN4通道，同時表達心肌特異性蛋白α-actin及cTnT；透射電

9、鏡觀察也發(fā)現(xiàn)其細胞內有明顯肌絲分布，但肌絲的排列紊亂與稀少，未見肌節(jié)樣結構形成，胞漿內可見豐富的顆粒、少量線粒體，其結構特點與乳鼠竇房結細胞超微結構非常相似。 6．經檢測mHCN4基因修飾大鼠MSCs可表達Cx43，其表達水平明顯較GFP組及未轉染組高，與心房肌細胞的Cx43表達水平無明顯差異。 7．透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)到mHCN4基因修飾大鼠MSCs可與相鄰細胞間可形成指狀交錯的連接，并可觀察到縫管連接的形成。 8

10、．經熒光光漂白后恢復技術(FRAP)檢測發(fā)現(xiàn)mHCN4陽性細胞組及mHCN4陽性細胞與心房肌細胞共培養(yǎng)組的平均熒光恢復率明顯高于GFP陽性細胞組及GFP陽性細胞與心房肌細胞共培養(yǎng)組，并與心房肌細胞組相似。 本研究結論： 1．mHCN4可成功轉染至大鼠MSCs，并可穩(wěn)定持續(xù)的表達。 2．mHCN4基因修飾的大鼠MSCs可記錄到If，表明其已具有心臟起搏細胞的電生理特性。 3．mHCN4基因修飾大鼠MSCs可