1、棉花黃萎病是一種由土傳真菌引起的維管束病害，在世界各產(chǎn)棉區(qū)均有分布，其病原菌主要為大麗輪枝菌和黑白輪枝菌。病菌侵染棉株后，會使葉片黃化，干枯，進而導致棉株死亡。該病害致病機制復雜，具體抗性機制尚未明確，加之缺乏有效防治藥物和抗病材料，使得棉花黃萎病防治愈加困難。從分子水平尋找抗性基因是研究棉花黃萎病的一個可行途徑。由于棉花基因組較大等原因，此方面工作進展緩慢。擬南芥作為模式植物，是黃萎病菌宿主之一，基因組背景已知，也可作為植物黃萎病抗性

2、機制的研究材料。
　　本研究依托實驗室構建的擬南芥與黃萎病菌的共同生長體系，篩選EMS誘變的擬南芥突變體庫，鑒定了一批對黃萎病菌敏感的擬南芥突變體。vsad1-1突變體是篩選到的一個突變體，該突變體在受到病菌侵染后，葉片快速黃化、萎縮，花青素積累量極低，葉綠素和生物量下降。前期通過遺傳學實驗證明該突變體為單基因隱性突變。利用圖位克隆技術，確定該突變基因位于擬南芥五號染色體上游，測序結果表明vsad1-1為基因At5g13930突變

3、產(chǎn)生的突變體，基因突變導致其編碼蛋白的第184位氨基酸由谷氨酸（E）變?yōu)橘嚢彼幔↘）。同期，我們還篩選到的另外一株黃萎病菌敏感型突變體vsad1-2，圖位克隆結果表明，vsad1-1和vsad1-2為等位突變體，vsad1-2是該基因點突變產(chǎn)生，其第49位蘇氨酸變?yōu)楫惲涟彼帷?br>　　為了驗證突變位點的正確性，我們先是使用了SALK的VSAD1基因點突變體tt4-2進行表型驗證。在MS培養(yǎng)基上，突變體tt4-2和vsad1-1在黃萎病

4、菌感染時植株表現(xiàn)出相似的發(fā)病特征：相比野生型而言，子葉過早黃化，花青素積累量極低，葉綠素含量下降，并且提前抽薹；土中侵染實驗表明，tt4-2和vsad1-1突變體死亡率比野生型WT升高15％左右。再者，我們用構建的VSAD1基因超表達載體轉化vsad1-1突變體，得到的超表達株系，植株花青素積累得到不同程度的恢復。以上結果說明，vsad1-1是由At5g13930基因發(fā)生突變導致。
　　為了分析VSAD1基因受黃萎病菌誘導時的表達

5、特征，實驗提取受黃萎病菌侵染的植株葉片RNA，通過RT-PCR實驗表明，植株受病菌侵染時，VSAD1基因表達量明顯上調；同時，VSAD1:GUS轉基因植株染色表明：正常狀態(tài)下，植株各部分均有輕微染色，當植株受到黃萎病菌侵染時，在葉片、下胚軸以及根部的染色明顯加深。植株GUS酶活性測定也表明，受黃萎病菌侵染后，植株的GUS酶活性上升43.6%。
　　為了分析vsad1突變體對黃萎病菌的敏感性是否與其植株體內(nèi)菌含量有關，論文參照已有文

6、獻中所報道的黃萎病菌β-微管蛋白序列，設計特異性引物VerACT，通過定量PCR技術檢測植株體內(nèi)黃萎病菌的含量。QRT-PCR結果表明vsad1-1體內(nèi)大麗輪枝菌含量是WT的2.86倍。另據(jù)文獻報道稱VSAD1參與植物花青素的合成，論文設計了實驗證明葡萄籽花青素提取物對黃萎病菌有一定的抑制作用，隨著濃度升高，病菌生長減速。并且，我們從擬南芥葉片中提取花青素進行同樣的抑制試驗，結果同葡萄籽花青素效果基本一致，擬南芥葉片花青素可以抑制大麗輪