1、植物過(guò)氧化氫酶（CAT）不但是光呼吸代謝中的關(guān)鍵酶，參與調(diào)控光合作用，而且在植物ROS清除系統(tǒng)中是不可或缺的。在水稻中有三個(gè)CAT被鑒定出來(lái)，分別命名為OsCATA，OsCATB，OsCATC，其中CATC是與光呼吸相關(guān)的CAT，也是本文的重點(diǎn)。本研究一方面采用釀酒酵母表達(dá)系統(tǒng)研究水稻葉片同工酶譜和CATC的酶學(xué)動(dòng)力學(xué)特性；同時(shí)通過(guò)瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)研究水稻CAT的亞細(xì)胞定位。另一方面運(yùn)用BiFC和pulldown技術(shù)研究OsNCA與OsCA

2、TC的互作關(guān)系，同時(shí)探討OsNCA對(duì)OsCATC的調(diào)控作用。獲得的主要結(jié)果如下：
　　1、OsCAT亞細(xì)胞定位和OsCATC生化及酶學(xué)特性
　　將水稻CAT的ORF序列構(gòu)建到亞細(xì)胞定位載體中，通過(guò)水稻瞬時(shí)表達(dá)技術(shù)分析水稻CAT的亞細(xì)胞定位情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsCATA定位在細(xì)胞質(zhì)，OsCATB和OsCATC定位在過(guò)氧化物酶體內(nèi)。將三個(gè)CAT構(gòu)建到酵母表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化酵母，提取其粗酶液與水稻葉片粗酶液一起進(jìn)行CN-PAGE電泳并活性

3、染色。結(jié)果表明水稻葉片里以O(shè)sCATC構(gòu)成的同工酶為主導(dǎo)，其全酶分子量很大，約為669kD，其亞基數(shù)為12個(gè)左右。將OsCATC的N端融合一個(gè)組氨酸標(biāo)簽后在酵母表達(dá)，經(jīng)過(guò)鎳柱純化后的純蛋白進(jìn)行酶學(xué)動(dòng)力學(xué)分析（應(yīng)用的底物H2O2濃度在5 mM-20 mM之間）。結(jié)果顯示OsCATC的Km值為43.12±9.07 mM；CATC的Vm為251.38±44.62 mmol H2O2?min-1?mg-1 protein；根據(jù)全酶分子量算出其K

4、cat值是28.01±4.95×105 S-1。
　　2、OsNCA亞細(xì)胞定位及其在水稻組織特異性表達(dá)
　　根據(jù)AtNCA1蛋白序列在NCBI水稻數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST，分辨到二個(gè)相似性很高的同源序列，根據(jù)其所在的染色體位置分別命名為OsNCA1、OsNCA2。根據(jù)OsNCA核酸序列設(shè)計(jì)特異的定量PCR引物進(jìn)行OsNCA時(shí)空表達(dá)模式分析。結(jié)果顯示，OsNCA在葉片里具有高水平的表達(dá)，兩者在不同時(shí)期的葉片里表達(dá)模式?jīng)]有明顯的區(qū)別

5、，同時(shí)兩者對(duì)不同的逆境的響應(yīng)也沒(méi)有明顯區(qū)別。將OsNCA構(gòu)建到原核表達(dá)載體進(jìn)行原核表達(dá)后將包涵體純化，純化的包涵體作為抗原送至公司制備多克隆抗體，anti-NCA的western blot結(jié)果顯示在水稻葉片里有NCA的蛋白表達(dá)。將OsNCA構(gòu)建到亞細(xì)胞定位載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體進(jìn)行瞬時(shí)表達(dá)發(fā)現(xiàn)，兩者均定位在細(xì)胞質(zhì)。
　　3、OsNCA與OsCATC的互作及其對(duì)CAT活性的調(diào)控
　　將OsNCA構(gòu)建到BiFC的2884載體上，與

6、本實(shí)驗(yàn)已有的3108-CATC一起共轉(zhuǎn)水稻原生質(zhì)體后在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光情況，結(jié)果顯示共轉(zhuǎn)后在細(xì)胞質(zhì)里能觀察到較強(qiáng)的熒光，表明OsNCA1或2和OsCATC互作，且互作場(chǎng)所就是細(xì)胞質(zhì)。將OsNCA1或2和OsCATC構(gòu)建到雙表達(dá)框pETDuet1載體上，將構(gòu)好載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌Rosetta(DE3)菌株里進(jìn)行共表達(dá)，共表達(dá)后pulldown驗(yàn)證其互作。結(jié)果顯示共表達(dá)后NCA1或2能被CATC同時(shí)洗脫下來(lái)，進(jìn)一步表明二個(gè)OsNCA