1、過氧化氫酶(Catalase，CAT)能夠清除植物體內(nèi)過多的過氧化氫，從而減少其對細胞的過氧化傷害，是植物中極為重要的逆境生理酶。本文對茶樹中CAT活力測定的pH、反應(yīng)時間等條件進行了優(yōu)化;研究了不同季節(jié)、不同品種等條件下茶樹CAT活力的變化規(guī)律;獲得了茶樹鮮葉中過氧化氫酶的分離純化方法，并初步探究了其最適溫度、pH等酶學(xué)性質(zhì)。
　　波長為240nm的紫外分光光度法和波長為405nm的鉬酸銨比色法用于測定茶樹中過氧化氫酶活力是可行

2、的。在以緩沖液、底物和粗酶液組成的反應(yīng)體系中，過氧化氫含量在240nm波長下、鉬酸銨與過氧化氫的絡(luò)合物的含量在405nm波長下與吸光度呈線性相關(guān)。分光光度法較國標規(guī)定的高錳酸鉀滴定法要簡單易行，且相對標準誤更小。
　　粗酶液以緩沖液從細胞破碎的鮮葉中進行抽提，在制備過程中，鮮葉的研磨方法對酶活力具有顯著影響，勻漿機高速勻漿和手動冰浴研磨酶活力顯著高于液氮研磨;離心速率和離心時間對酶活力無顯著性影響;聚乙烯吡咯烷酮(PVP)具有極顯

3、著的影響，當(dāng)PVP在鮮葉總重的10％以上時，CAT才能表現(xiàn)出較高的活力，反之，則CAT幾乎無活力;若對粗酶液做進一步的除雜，包括過0.45μm濾膜和活性碳吸附，前者將使CAT的活力損失大部分，而后者則使CAT的活力全部消失;酶活力測定過程中，每3 mL反應(yīng)液中加入0.05 mL的粗酶液以及0.4mL的過氧化氫底物是最為理想的反應(yīng)體系，反應(yīng)時間以不高于5 min為佳;緩沖液為PBS或Tris-HCl溶液，離子濃度在0.1～0.2 M之間，

4、pH控制在7.2～7.8。
　　以優(yōu)化后的CAT活力測定方法，對茶樹不同條件下CAT活力變化規(guī)律進行了研究。在相同地點種植的茶樹品種，春季，其新梢的酶活力差異不大，而到了夏季，不同品種間的CAT活力的差異性變大，進入秋季，CAT活力普遍維持在較高水平，此時差異性又再次減小;不同季節(jié)，同一品種的茶樹過氧化氫酶活力差異變化顯著;總體上生長在主干的鮮葉，其CAT活力要高于新生枝條上的鮮葉，而在同一枝條上，位于枝條中間的鮮葉，其CAT活力

5、要高于位于枝條兩端的鮮葉;剛采下來的茶樹鮮葉酶活力約在185 U/g，而在攤放2h之后，其酶活力上升了30％，而隨著攤放時間的進一步延長至四小時，酶活力急劇下降，隨后酶活力一直低于初始活力，并在24 h之內(nèi)一直穩(wěn)定在100 U/g左右。
　　通過硫酸銨分級沉淀和Sephacryl S-200HR凝膠樹脂柱層析后，茶樹鮮葉中CAT比活力提高了48.58倍。酶活力回收率達到了33.19％。通過SDS-PAGE分析，該樣品達到電泳純。<

6、br>　　茶樹鮮葉中CAT亞基蛋白分子量為50.9 kD，Km為7.6 mmol/L，最適反應(yīng)溫度為36℃，最適反應(yīng)pH為7.4。茶樹中CAT的耐熱性較好，50℃時，短時間內(nèi)，茶樹CAT活力略有下降，當(dāng)孵育時間達到60min時，CAT活力還剩56.3％;70℃時，茶樹CAT酶活力在10 min后還剩33.4％，而在1h后，酶活力低于10％，90℃條件下孵育10 min則完全失活。對酸堿的耐受性表現(xiàn)為對堿性的耐受性要強于對酸性的耐受性。在

7、pH10.0和pH9.0的緩沖液中孵育60min后，酶活力仍然分別保持了14.5％和37.3％;而pH為6.0、5.0、4.0時，孵育60min中后，酶活力則僅保持了15.7％、3.6％、3.6％。
　　對不同的抑制劑和激活劑的研究結(jié)果表明:不同的有機溶劑，對茶樹中CAT活力的影響效果是不一樣，甲醇只有在較高濃度時，才能對茶樹CAT活力產(chǎn)生抑制作用，而乙醇在較低濃度即對茶樹CAT活力產(chǎn)生了抑制作用。不同化合物對茶樹CAT活力的影響

8、是不同的，較低濃度的十二烷基硫酸鈉(SDS)即可使茶樹CAT大量失活;乙二胺四乙酸(EDTA)濃度在10～30 mmol/L范圍內(nèi)，CAT活力損失量與EDTA添加量呈正相關(guān)，EDTA含量繼續(xù)增加，CAT活力不再下降;尿素對茶樹CAT的影響相對較小，CAT酶活力始終保持在50％左右，未出現(xiàn)較大波動。金屬離子對茶樹CAT活力的影響同樣表現(xiàn)出極大的差異性。Co2+、Zn2+對茶樹CAT活力起著激活的作用;K+、Mg2+對茶樹CAT活力的影響并