1、目的：
　　 1.研究大鼠骺板軟骨細(xì)胞及前軟骨干細(xì)胞（PSCs）接種殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合多孔支架體外三維培養(yǎng)，探討其構(gòu)建組織工程化骺板的可行性。
　　 2.研究動態(tài)壓應(yīng)力對體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細(xì)胞外基質(zhì)以及甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）mRNA表達(dá)的影響。
　　 3.研究動態(tài)壓應(yīng)力對體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細(xì)胞Sox9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平的影響，并初步探討其力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。
　　 4.研究動態(tài)張

2、應(yīng)力對體外培養(yǎng)的大鼠生長板軟骨細(xì)胞甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白（PTHrP）表達(dá)的影響，并初步探討細(xì)胞骨架是否參與該力學(xué)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。
　　 方法：
　　 1.冷凍干燥法制備殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合三維多孔支架；機(jī)械分離與酶消化相結(jié)合分離骺板軟骨細(xì)胞；免疫磁珠分選前軟骨干細(xì)胞（PSCs），誘導(dǎo)其向軟骨細(xì)胞特性方向分化；細(xì)胞接種支架體外三維培養(yǎng)，掃描電鏡觀察細(xì)胞粘附、增殖，MTT 評估細(xì)胞增殖狀況，RT-PCR檢測成軟骨分化指標(biāo)，阿辛藍(lán)

3、法測定細(xì)胞蛋白多糖（GAG）
　　 的合成情況。
　　 2.分離并體外培養(yǎng)大鼠骺板軟骨細(xì)胞，用自行設(shè)計制作的可控細(xì)胞壓力加載裝置對細(xì)胞進(jìn)行不同強(qiáng)度和持續(xù)時間的壓應(yīng)力刺激，采用RT-PCR技術(shù)分別檢測各組軟骨特性細(xì)胞外基質(zhì)（Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原以及aggrecan）以及PTHrP mRNA表達(dá)并進(jìn)行半定量分析。
　　 3.大鼠骺板軟骨細(xì)胞分組予以動態(tài)壓應(yīng)力和鈣離子拮抗劑硝苯地平作用24 小時。實(shí)時定量PCR及West

4、ern blot 檢測分析各組細(xì)胞的Sox9 mRNA 及蛋白表達(dá)情況；
　　 細(xì)胞行Fluo-3/AM 染色，激光共聚焦顯微鏡（LSCM）觀測胞內(nèi)鈣離子熒光強(qiáng)度。
　　 4.免疫磁珠分選骺板前肥大/肥大層軟骨細(xì)胞，細(xì)胞予以不同強(qiáng)度（3％、6％、12％形變）的動態(tài)張應(yīng)力（1Hz）刺激作用24 小時，實(shí)時定量PCR和Western blot 檢測各組細(xì)胞的PTHrP mRNA和蛋白的表達(dá)情況；流式細(xì)胞技術(shù)檢測細(xì)胞周期變化。

5、細(xì)胞予以一定的張應(yīng)力刺激和細(xì)胞骨架松弛素D（2μM），F(xiàn)ITC 標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽行細(xì)胞骨架微絲（F-actin）染色，激光共聚焦掃描顯微鏡（LSCM）觀測各組細(xì)胞骨架形態(tài)變化。
　　 結(jié)果：
　　 1.采用冷凍干燥法制備的殼聚糖/藻酸鹽復(fù)合三維多孔支架具有較好的孔徑及孔隙率；PSCs 體外培養(yǎng)增殖迅速，誘導(dǎo)后的PSCsⅡ型膠原免疫細(xì)胞染色及甲苯胺蘭、番紅O 染色陽性；骺板軟骨細(xì)胞和誘導(dǎo)后的PSCs 接種支架后生長良好并分泌

6、細(xì)胞外基質(zhì)，Sox9、Ⅱ型膠原均陽性表達(dá)，培養(yǎng)14天后培養(yǎng)液GAG 含量兩組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 2.骺板軟骨細(xì)胞在30 mmHg、60 mmHg、90 mmHg 動態(tài)壓力培養(yǎng)環(huán)境下生長良好，各時間點(diǎn)PTHrP、Ⅱ型膠原以及aggrecan mRNA表達(dá)水平高于對照組；Ⅹ型膠原表達(dá)水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 3.骺板軟骨細(xì)胞在90 mmHg（12 kPa）動態(tài)壓應(yīng)力下培養(yǎng)24 小時后，實(shí)時定量PCR

7、結(jié)果顯示單純壓應(yīng)力組其Sox9 mRNA 及蛋白表達(dá)水平明顯高于未受力的對照組；添加硝苯地平的壓應(yīng)力組其Sox9表達(dá)水平亦高于對照組，但低于單純壓應(yīng)力組。LSCM 結(jié)果顯示各組胞內(nèi)鈣離子平均熒光強(qiáng)度差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 4.動態(tài)張應(yīng)力對骺板前肥大/肥大軟骨細(xì)胞PTHrP表達(dá)的影響呈劑量和時間依賴性，高強(qiáng)度（12％形變）的張應(yīng)力增加細(xì)胞死亡率。強(qiáng)度為6％形變的動態(tài)張應(yīng)力（1Hz）作用24 小時明顯上調(diào)PTHrP表達(dá)，LSCM

8、結(jié)果顯示細(xì)胞F-actin在受力后發(fā)生重構(gòu)。細(xì)胞骨架松弛素D 能部分阻斷應(yīng)力所致的細(xì)胞PTHrP表達(dá)的上調(diào)。
　　 結(jié)論：
　　 1.PSCs 誘導(dǎo)后向軟骨細(xì)胞功能方向分化，與殼聚糖/藻酸鹽三維多孔支架復(fù)合有望用于骺板損傷修復(fù)。
　　 2.適當(dāng)?shù)膭討B(tài)壓應(yīng)力能有效促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠骺板軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原及aggrecanmRNA表達(dá)，PTHrP在此細(xì)胞力學(xué)信號響應(yīng)過程中可能起重要作用。
　　 3.適當(dāng)?shù)膭討B(tài)壓