1、目的:構建轉錄端粒酶逆轉錄酶基因小發(fā)夾RNA(hTERT—shRNA)的復制缺陷型和條件增殖型腺病毒(CRAds)。 方法: 1.設計能轉錄hTERT—shRNA模板的DNA序列，退火后克隆至pCA13質粒，構建重組質粒pCA13-hTERT。 2.用Bg1II從pCA13-hTERT酶切出包含CMV啟動子及hTERT-shRNA模板的表達框。 3．將此表達框克隆入經(jīng)BglII酶切并去磷后的條件增殖腺病毒

2、質粒pZD55，構建重組質粒pZD55-hTERT。 4．將pCA13-hTERT、pZD55-hTERT與腺病毒右臂質粒pBHGE3共轉染293細胞，9-12d后出現(xiàn)病毒空斑。 5.提取重組腺病毒的DNA，PCR鑒定正確者即為復制缺陷型腺病毒Ad-hTERT和條件增殖腺病毒ZD55-hTERT。 6.鑒定正確后大量擴增，氯化銫梯度離心純化，噬斑計數(shù)法測滴度。 7.免疫印跡法檢測Ad-hTERT、ZD55

3、-hTERT在腫瘤細胞中E1A的表達。 8.結晶紫染色法評價Ad-hTERT、ZD55-hTERT對P53突變的腫瘤細胞的殺傷作用。 結果: 1.酶切分析、測序鑒定表明pCA13-hTERT構建成功。 2.PCR、酶切分析、測序鑒定表明pZD55-hTERT構建成功。 3.PCR鑒定表明Ad-hTERT包含目的基因，但E1區(qū)缺失；ZD55-hTERT包含目的基因，且無野生型腺病毒污染。 4

4、.Ad-hTERT滴度為4×10<'10>、ZD55-hTERT滴度為1×10<'11>PFU／ml。 5.免疫印跡法證實ZD55-hTERT在腫瘤細胞中表達E1A，Ad-hTERT在腫瘤細胞中不表達ElA。 6．結晶紫染色法表明ZD55-hTERT對p53突變的腫瘤細胞殺傷作用明顯優(yōu)于ZD55-EGFP、Ad-hTERT． 結論: 成功構建轉錄hTERT-shRNA的復制缺陷型腺病毒Ad-hTERT和條件增殖型