1、肝癌是嚴重危害我國人群健康的主要腫瘤之一，因其傳統(tǒng)手術、放療、化療效果均不甚理想，基因治療策略被認為具有良好的應用前景。而基因治療需要面對的一個首要問題即為其作用的靶向性或特異性。目前，研究者普遍采用的方法即利用組織特異性調控元件特異啟動治療基因在相應組織中的表達。甲胎蛋白在大多數原發(fā)性肝細胞癌患者血清中均明顯升高，甲胎蛋白啟動子已廣泛應用于肝癌的靶向性基因治療中。研究已證實，人原發(fā)性肝癌中存在著高頻率的p16基因失活，其中p16的5’

2、CpG島甲基化及純合性缺失發(fā)生頻繁。因此，將外源性p16基因導入肝癌細胞中，有可能恢復p16對細胞增殖的抑制作用、促進細胞凋亡、抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。 本研究利用AdEasyXLAdenoviralVectorSystem，將外源性p16基因分別置于人α-甲胎蛋白核心啟動子AF0.3、CMV啟動子及HREAF雜合啟動子下游，插入穿梭載體質粒中，再將線性化的穿梭質粒分別轉化BJ5183-AD-1細菌，與腺病毒骨架質粒pAdEasy-

3、1在細菌內進行同源重組產生出重組腺病毒載體質粒，經PacⅠ酶切暴露左右兩端ITR后，分別轉染HEK293細胞，構建、包裝出攜帶外源性p16基因的重組復制缺陷型腺病毒Ad-CMV-p16、Ad-AFP-p16、Ad-HREAF-p16和AdTrack-CMV-p16。 選擇純化的重組腺病毒Ad-AFP-p16作為目標病毒，感染人肝癌細胞系HepG2和Bel-7402，經MTT比色實驗、WesternBlotting檢測，證實體外感

4、染Ad-AFP-p16的HepG2和Bel-7402可高效表達P16蛋白，細胞生長受到明顯抑制，而人正常肝細胞LO2及非肝癌細胞在感染Ad-AFP-p16后生長未受明顯抑制。進一步經流式細胞術分析、DNA片斷化分析及Hoechst33258核染色，顯示Ad-AFP-p16可特異誘導肝癌細胞發(fā)生凋亡，而感染Ad-AFP-p16的人正常肝細胞LO2未見明顯凋亡。經體內初步試驗亦可看出，Ad-AFP-p16對小鼠肝癌細胞株H22的體內成瘤具有