1、背景和目的 骨肉瘤是一種臨床常見的成骨性惡性腫瘤，約占所有骨腫瘤的20％。其惡性程度高，好發(fā)于青少年。由于80％的患者在就診時即已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，20％-30％的患者無論采取何種治療，預(yù)后均極為不佳，近30年來，骨肉瘤的總體療效相對上世紀(jì)80年代并無很大的提高。如何進一步提高惡性骨腫瘤患者的療效和生存率，仍是臨床亟待解決的重要課題。 大量研究表明人類多種腫瘤細(xì)胞和體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞都可產(chǎn)生VEGF(vascularendot

2、hlialgrowthfactor，VEGF)，多種腫瘤組織VEGF表達也明顯高于其來源的正常組織，腫瘤組織VEGF表達水平與腫瘤血管化程度，惡性度呈正相關(guān)。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種重要的促血管形成因子，通過增加微血管的通透性和特異性的與血管內(nèi)皮細(xì)胞受體結(jié)合，促進血管內(nèi)皮細(xì)胞的分裂和增殖，進而導(dǎo)致新生血管的生成，具有促血管形成和增加血管通透性的雙重功能，在腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后等方面均起著重要的作用。 因此如何有效的抑

3、制VEGF的表達是腫瘤治療的關(guān)鍵所在。目前研究較多的有抗VEGF及VEGFR的單克隆抗體，反義寡核苷酸片段等，但效果不甚理想。近幾年來興起的RNA干擾技術(shù)，為腫瘤的分子生物治療開辟了新的途徑。與傳統(tǒng)基因沉默技術(shù)相比，具有效果強、持續(xù)時間長等優(yōu)勢，目前這一技術(shù)已在腫瘤的基因治療方面顯示出誘人的前景。為此本實驗設(shè)計并構(gòu)建了針對VEGF的siRNA表達載體，轉(zhuǎn)染入人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63觀察其對細(xì)胞VEGF表達的沉默效應(yīng)。 方法

4、 依據(jù)GenBank中VEGF基因(BC065522)的序列，利用以下幾個網(wǎng)址提供的設(shè)計分析軟件進行設(shè)計http：//www.ambion.com/techlib/misc/siRNAdesign.html：http：//www2.takara-bio.co.jp/sirna-d/top.php。對上述候選siRNA序列通過美國生物技術(shù)信息中心(NationalCenterforBiotechnologyInformation)的在線

5、同源序列檢索http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast，確定針對VEGF的siRNA序列。合成VEGF發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸，退火成雙鏈DNA，克隆入T載體，利用α互補和T7/SP6PCR擴增篩選鑒定重組子pGEM-T-VEGF；用BglⅡ和HindⅢ雙酶切重組子pGEM-T-VEGF和siRNA表達載體pSuperneo；將雙粘VEGF發(fā)卡樣siRNA片段亞克隆入siRNA表達載體pSuperneo中；利用B

6、glⅡ和HindⅢ雙酶切篩選鑒定重組子pSuperneo-VEGF；對插入序列進行DNA序列分析。將siRNA表達載體pSuperneo-VEGF轉(zhuǎn)入人骨肉瘤細(xì)胞系MG-63中，用RT-PCR方法檢測細(xì)胞VEGFmRNA表達水平。 結(jié)果 1.得到19個侯選VEGFsiRNA靶區(qū)段，對上述候選序列通過美國生物技術(shù)信息中心的在線同源序列檢索，最后確定的編碼序列是19個堿基，TCATCACGAAGTGGTGAAG(573-59

7、1nt)。 2.siRNA發(fā)卡DNA的退火后，電泳可見明亮條帶，位于約70bp處，與設(shè)計完全一致。 3.退火產(chǎn)物與pGEM-TEasy連接后，轉(zhuǎn)化JMl09，篩選鑒定后得到重組子pGEM-T-VEGF。 4.亞克隆后，用BglⅡ/HindⅢ雙酶切對重組質(zhì)粒進行鑒定，得到pSuperneo-VEGF。 5.對重組子pSuperneo-VEGF插入片段DNA序列結(jié)果與設(shè)計完全一致。 6.轉(zhuǎn)染pSupe

8、rneo-VEGF的實驗組骨肉瘤細(xì)胞中VEGFmRNA表達幾乎完全被抑制，而兩個對照組(無關(guān)siRNA對照組和空載體對照組)和未轉(zhuǎn)染的骨肉瘤細(xì)胞系MG-63細(xì)胞中都存在較高水平的VEGFmRNA表達。 結(jié)論 1.設(shè)計出針對VEGF的發(fā)卡樣siRNA寡核苷酸片段。 2.成功構(gòu)建出針對VEGF的siRNA表達載體pSuperneo-VEGF 3.pSuperneo-VEGF轉(zhuǎn)染骨肉瘤細(xì)胞后能顯著降低細(xì)胞VEG