1、一、研究目的：建立基于Smad3的抗瘢痕增生藥物高通量篩選體系，為燒傷后瘢痕增生防治藥物的研究提供一個理想的技術(shù)平臺。 二、研究方法：首先采用PCR方法從質(zhì)粒pGL2-control中擴(kuò)增獲得SV40弱啟動子，并以其替換質(zhì)粒pEGFP-N1中的強(qiáng)啟動子CMVIE，獲得pSV40-EGFP質(zhì)粒。提取兩份pSV40-EGFP質(zhì)粒，其中一份以XhoⅠ、HindⅢ雙酶切獲得含有EGFP的質(zhì)粒骨架，另一份用BglⅡ、HindⅢ雙酶切獲得含

2、SV40啟動子的質(zhì)粒片段。用T4-DNA連接酶連接含有EGFP的質(zhì)粒骨架、含SV40啟動子的質(zhì)粒片段及人工合成的4×COL1A2基序(具有XhoⅠ、BglⅡ粘端)，獲得p4COL1A2-EGFP質(zhì)粒，并以pd2EGFP-Basic質(zhì)粒中d2EGFP片段替換p4COL1A2-EGFP質(zhì)粒中的EGFP片段，最終獲取報(bào)告質(zhì)粒p4COL1A2-d2EGFP。將p4COL1A2-d2EGFP報(bào)告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(NIH3T3細(xì)胞)，G4

3、18篩選后獲得Smad3反應(yīng)性報(bào)告細(xì)胞株NIH3T3-d2EGFP。培養(yǎng)后加入TGF-β1(12.5ng/ml)，通過熒光顯微鏡觀察及流式細(xì)胞儀檢測不同時相點(diǎn)NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞d2EGFP的表達(dá)。人工合成針對Smad3的“圈套”寡核苷酸(TFD)單鏈，退火后形成Smad3環(huán)狀缺口啞鈴型“圈套”寡核苷酸，并以0、0.5、1和2mg/L的劑量轉(zhuǎn)染NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞株，半小時后加入TGF-β1，觀察TFD對TGF-β1

4、誘導(dǎo)調(diào)控d2EGFP表達(dá)的抑制作用。將NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞株凍存3個月后，復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)3個月，加入TGF-β1，觀察不同時相點(diǎn)d2EGFP的表達(dá)情況，據(jù)此評價Smad3反應(yīng)性報(bào)告細(xì)胞株NIH3T3-d2EGFP的穩(wěn)定性。 三、主要結(jié)果：1.質(zhì)粒酶切、PCR以及測序鑒定結(jié)果表明，Smad3反應(yīng)性報(bào)告基因載體p4COL1A2-d2EGFP序列符合預(yù)期設(shè)想，報(bào)告質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2.將報(bào)告質(zhì)粒p4COL1A2-d2E

5、GFP轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，獲得Smad3反應(yīng)性報(bào)告細(xì)胞株NIH3T3-d2EGFP，提取NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果表明：細(xì)胞株NIH3T3-d2EGFP中含有p4COL1A2-d2EGFP質(zhì)粒?；赟mad3反應(yīng)性報(bào)告細(xì)胞株構(gòu)建成功。 3.TGF-β1誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，加入TGF-β1前及加入TGF-β10h時，NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞僅在400倍顯微鏡下觀察可見

6、少量弱熒光；加入TGF-β14h時NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞出現(xiàn)明顯綠色熒光，相對陽性細(xì)胞率為6.22，相對熒光強(qiáng)度為3.22；12h達(dá)到高峰，相對陽性細(xì)胞率為17.53，相對熒光強(qiáng)度為11.21；24h時細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度及相對陽性細(xì)胞率均明顯下降；36h時細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度(2.13±0.53)及相對陽性細(xì)胞率(3.64±0.73)均進(jìn)一步降低。 4.Smad3TFD抑制表達(dá)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在0mg/LSmad3TFD組(即單

7、純TGF-β1誘導(dǎo)組)，幾乎所有的細(xì)胞均為強(qiáng)亮的綠色熒光細(xì)胞，0.5mg/LSmad3TFD組可見略亮、較少的熒光細(xì)胞，1mg/L及2mg/LSmad3TFD組均未見熒光細(xì)胞。0.5mg/LSmad3TFD組、1mg/LSmad3TFD組及2mg/LSmad3TFD組細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度和相對陽性細(xì)胞率均顯著低于0mg/LSmad3TFD組(P＜0.01)，1mg/L和2mg/LSmad3TFD組細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度及相對陽性細(xì)胞率無明顯差異(

8、P＞0.05)。 5.將NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞株凍存90天，復(fù)蘇并傳代培養(yǎng)3個月，加入TGF-β10h時，NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞僅在400倍熒光顯微鏡下觀察可見少量帶弱熒光的細(xì)胞；加TGF-β1誘導(dǎo)4h后NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞可見較亮綠色熒光，相對陽性細(xì)胞率為5.72，相對熒光強(qiáng)度為2.93；12h時，細(xì)胞熒光強(qiáng)亮，相對熒光細(xì)胞率達(dá)16.20，相對熒光強(qiáng)度為10.54；24h時細(xì)胞相對熒光強(qiáng)度及相對陽性細(xì)

9、胞率均明顯下降；36h后，熒光減弱變暗，相對熒光細(xì)胞率為1.81，相對熒光強(qiáng)度為2.91，說明NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞株經(jīng)凍存、復(fù)蘇、傳代后仍能有效反映TGF-β1對Smad3的誘導(dǎo)激活作用，以NIH3T3-d2EGFP細(xì)胞株作為抗瘢痕增生藥物高通量篩選體系具有可靠的穩(wěn)定性。 四、結(jié)論：1.成功構(gòu)建了以Smad3順式作用元件4×COL1A2基序?yàn)樵鰪?qiáng)子、以SV40為啟動子，以d2EGFP為報(bào)告基因的真核表達(dá)載體p4COL1

10、A2-d2EGFP。 2.將真核表達(dá)載體p4COL1A2-d2EGFP轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞，經(jīng)G418篩選后，獲得了Smad3反應(yīng)性報(bào)告細(xì)胞株NIH3T3-d2EGFP，即基于Smad3的抗瘢痕增生藥物高通量篩選體系。 3.經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)表達(dá)實(shí)驗(yàn)及Smad3TFD抑制d2EGFP表達(dá)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，NIH3T3-d2EGFP報(bào)告細(xì)胞株可通過熒光強(qiáng)弱變化敏感地監(jiān)測Smad3的活性改變，從而反映外源性物質(zhì)對TGF-β作用的阻斷