1、中國醫(yī)科大學博士學位論文特異性下調內質網分子伴侶GRP94對人大腸癌細胞生物學特性影響的研究姓名：陳瑤申請學位級別：博士專業(yè)：細胞生物學指導教師：宋今丹2003.3.1功能，還有助于理解UPR通路的變化。基于此，我們選擇了人大腸癌細胞株CCL229作為研究對象，通過特異性核酶打靶的方式，下調細胞中GRP94的表達水平，觀察其對人大腸癌細胞某些生物學特性及UPR通路的影響，加深對GRP94、UPR和腫瘤這三者間關系的了解。方法1穩(wěn)定下調G

2、RP94的人大腸癌細胞克隆株的構建(1)分別對含有特異性打靶GRP94核酶的質粒pRe／RSV—ribol和對照組質粒pRe／RSV進行小量提取、PvulI酶切鑒定?！?2)測定pRc／RSV—ribol和pRe／RSV的基因序列，以質粒DNA大量提純方法獲得純化的質粒。(3)按照Fugene?！?transfectionreagent說明書分別用兩種質粒轉染人大腸癌細胞CCL229。(4)分別通過RT—PER方法和Westernblo

3、t方法從mRNA和蛋白水平檢測GRP94的表達情況，以此鑒定轉染成功的陽性克隆株。2檢測GRP94表達水平下降對人大腸癌細胞生物學特性的影響(1)光鏡下觀察細胞的形態(tài)、貼壁狀態(tài)、聚集生長能力和生長速度。(2)繪制細胞生長曲線，計算細胞群體倍增時間。(3)檢測細胞聚集能力，計算細胞的聚集度。(4)流式細胞儀檢測細胞周期分布。3檢測GRP94表達水平下降對相關分子伴侶GRP78和PDI的影響(1)分別通過RT—PER方法和Westernbl