1、研究背景與目的:
　　肺癌是目前世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤,主要和直接的致死原因是腫瘤的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。目前認(rèn)為,上皮來(lái)源的惡性腫瘤在轉(zhuǎn)移早期經(jīng)歷了上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT),即腫瘤細(xì)胞上皮表型喪失,出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞或間質(zhì)來(lái)源細(xì)胞的表型,表現(xiàn)為細(xì)胞間粘附能力降低及細(xì)胞侵襲及遷移能力增強(qiáng)。
　　抑癌基因DAL-1首先在肺腺癌中發(fā)現(xiàn),近年來(lái)研究表明,其表達(dá)缺失與多種腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān),但其在轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制至今尚未闡明。細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)顯

2、示DAL-1蛋白表達(dá)于細(xì)胞間連接處,與細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合,參與細(xì)胞粘附和運(yùn)動(dòng)的調(diào)節(jié)。在腫瘤組織其表達(dá)缺失可引起腫瘤細(xì)胞間粘附能力下降,侵襲和遷移能力增強(qiáng),提示DAL-1與EMT的發(fā)生有關(guān)。我們前期采用免疫組化在人肺癌組織標(biāo)本中檢測(cè)發(fā)現(xiàn):DAL-1與E-cadherin表達(dá)呈正相關(guān),與Vimentin、Snail表達(dá)呈負(fù)相關(guān),由此推測(cè)DAL-1可能通過(guò)調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程,影響肺癌的轉(zhuǎn)移。
　　本研究擬采用基因克隆技術(shù)構(gòu)建過(guò)表達(dá)D

3、AL-1載體,轉(zhuǎn)染至肺癌A549細(xì)胞中,驗(yàn)證DAL-1與EMT的關(guān)系;采用雙熒光素酶報(bào)告基因技術(shù)及免疫共沉淀方法研究DAL-1對(duì)EMT的調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:
　　一、采用基因克隆的方法在含DAL-1編碼序列的質(zhì)粒上添加終止密碼子,克隆至真核表達(dá)載體pcDNA3中,獲得重組質(zhì)粒pcDNA3/DAL-1;經(jīng)EcoRI、XhoI雙酶切后,進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。
　　二、RT-PCR及Western Blot方法檢測(cè)7株人肺癌

4、細(xì)胞株中DAL-1mRNA和蛋白表達(dá)情況,篩選出不表達(dá)DAL-1的肺癌A549細(xì)胞。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒pcDNA3/DAL-1轉(zhuǎn)染至A549細(xì)胞中,在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平檢測(cè)DAL-1的表達(dá)。
　　三、脂質(zhì)體介導(dǎo)重組質(zhì)粒pcDNA3/DAL-1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至肺癌A549細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48h后采用熒光定量PCR及Western Blot方法檢測(cè)過(guò)表達(dá)DAL-1后E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin

5、及Snail的mRNA及蛋白表達(dá)情況;轉(zhuǎn)染細(xì)胞經(jīng)G418篩選培養(yǎng)2周后,擴(kuò)大培養(yǎng)獲得穩(wěn)定表達(dá)DAL-1的細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后第3、4、5周采用熒光定量PCR及Western Blot方法檢測(cè)DAL-1、E-cadherin、β-catenin、Vimentin、Fibronectin及Snail的mRNA及蛋白表達(dá)情況,分析DAL-1與EMT的關(guān)系。
　　四、構(gòu)建含有E-cadherin啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告基因載體,采用雙熒光素酶報(bào)

6、告基因方法檢測(cè)DAL-1轉(zhuǎn)染組及空載體組的E-cadherin啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性,分析DAL-1在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)E-cadherin的調(diào)節(jié)作用;利用穩(wěn)定表達(dá)DAL-1的肺癌細(xì)胞模型,采用免疫共沉淀方法獲得在細(xì)胞內(nèi)與DAL-1結(jié)合的蛋白質(zhì),經(jīng)SDS-PAGE變性電泳分離后,切取實(shí)驗(yàn)組與空載體組的差異蛋白條帶經(jīng)MALDO-TOF/TOF質(zhì)譜檢測(cè),分析DAL-1在蛋白水平對(duì)E-cadherin的影響。
　　結(jié)果:
　　一、重組質(zhì)粒pcDN

7、A3/DAL-1經(jīng)雙酶切證實(shí)插入片段大小與預(yù)期一致,測(cè)序結(jié)果顯示終止密碼子添加成功,擴(kuò)增的目的片段完全匹配,成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3/DAL-1;經(jīng)RT-PCR、Western Blot檢測(cè),證明DAL-1重組質(zhì)粒能在肺癌A549細(xì)胞中高效表達(dá)。
　　二、pcDNA3/DAL-1瞬時(shí)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48h后,熒光定量PCR及Western Blot方法檢測(cè)結(jié)果顯示:與空載體組相比,實(shí)驗(yàn)組E-cadherin mRNA及蛋白

8、表達(dá)均顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而β-catenin、Vimentin、Fibronectin及Snail在mRNA及蛋白水平與空載體組相比,未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　三、穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3/DAL-1后,熒光定量PCR及Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示:與空載體組相比,實(shí)驗(yàn)組DAL-1表達(dá)顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。在穩(wěn)轉(zhuǎn)第3周,轉(zhuǎn)染細(xì)胞DAL-1表達(dá)達(dá)到平臺(tái)期,此時(shí)實(shí)驗(yàn)組E-cadh

9、erin、β-catenin的mRNA及蛋白表達(dá)較空載體組顯著升高,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);Vimentin的mRNA及蛋白表達(dá)較空載體降低,組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05);而Fibronectin、Snail的mRNA及蛋白表達(dá)與空載體組相比,未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。
　　四、成功擴(kuò)增E-cadherin啟動(dòng)子片段,經(jīng)雙酶切證實(shí)插入片段的大小及方向均與設(shè)計(jì)的一致,測(cè)序結(jié)果與Genbank比對(duì)顯示完全匹配,成功構(gòu)建

10、含E-cadherin啟動(dòng)子片段的熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒。采用雙熒光素酶報(bào)告基因方法檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組較空載體組的E-cadherin啟動(dòng)子活性顯著升高,組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。
　　五、免疫共沉淀獲得細(xì)胞內(nèi)與DAL-1存在相互作用的蛋白,SDS-PAGE變性電泳后獲得差異蛋白條帶,經(jīng)MALDO-TOF/TOF質(zhì)譜檢測(cè)分別是4.1B、E-cadherin、HSPA5、P4HA1、β-tubulin,14-3-3ε蛋白結(jié)合。

11、>　　結(jié)論:
　　一、成功構(gòu)建DAL-1基因的真核表達(dá)載體pcDNA3/DAL-1,并證明其在肺癌A549細(xì)胞中能夠高效表達(dá)。
　　二、首次發(fā)現(xiàn)DAL-1通過(guò)上調(diào)E-cadherin、β-catenin表達(dá),下調(diào)Vimentin表達(dá),抑制EMT的發(fā)生。
　　三、DAL-1通過(guò)與E-cadherin的啟動(dòng)子結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)E-cadherin的表達(dá);DAL-1蛋白與E-cadherin蛋白結(jié)合,可能通過(guò)維持E-cad