1、背景和目的:
　　腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤患者死亡的首要原因,而骨是腫瘤轉(zhuǎn)移的好發(fā)部位之一。約30~40％晚期肺癌患者出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移,肺癌骨轉(zhuǎn)移多為溶骨性損害,導(dǎo)致嚴(yán)重骨痛、病理性骨折、高鈣血癥及脊髓壓迫等一系列并發(fā)癥,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生存時間。因此,積極防治肺癌骨轉(zhuǎn)移具有重要的意義。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移到骨髓后分泌多種因子,并與骨微環(huán)境中的造血干細(xì)胞、破骨細(xì)胞(osteoclasts, OCs)、成骨細(xì)胞(osteoblasts, OBs)等

2、宿主細(xì)胞及骨髓基質(zhì)發(fā)生相互作用,形成“惡性循環(huán)”。阻斷此過程可望有效干預(yù)腫瘤骨轉(zhuǎn)移進(jìn)程,但目前肺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)分子機制仍不明確。
　　Jagged1是 Notch通路配體之一,其與相鄰細(xì)胞的 Notch特異性受體結(jié)合后激活Notch通路,進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)作用。Notch通路可被γ-分泌酶抑制劑3,5-二氟笨乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸 t-丁酯{N-[N-(3,5-difluorophenacetyl)-L-alanyl]- S

3、-phenylglycine t-butyl ester,DAPT}阻斷。Notch信號通路在胚胎發(fā)育中起到重要作用,對成體細(xì)胞分化、增殖等生理功能具有重要的調(diào)控作用,其異?；罨c很多疾病的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。近期的研究表明,Jagged1/Notch信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中均具有重要作用。高表達(dá)Jagged1的前列腺癌和乳腺癌患者預(yù)后不佳,同樣Notch高表達(dá)的非小細(xì)胞肺癌患者預(yù)后也不佳。Notch通路在生理狀態(tài)對破骨前體細(xì)

4、胞的分化成熟及功能具有重要的調(diào)控作用,但 Jagged1/Notch通路在肺癌骨轉(zhuǎn)移等病理條件下對破骨前體細(xì)胞的影響還未見相關(guān)報道。
　　本課題通過免疫組織化學(xué)染色檢測 Jagged1在肺癌骨轉(zhuǎn)移患者轉(zhuǎn)移灶及癌旁組織標(biāo)本的表達(dá)情況,以明確Jagged1與肺癌骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系。并通過體外實驗,研究Jagged1對 CD14+單核細(xì)胞增殖及其向破骨細(xì)胞分化的影響,進(jìn)而研究 Notch通路在肺腺癌A549細(xì)胞條件培養(yǎng)液(Conditione

5、d medium, CM)調(diào)控CD14+單核細(xì)胞增殖及向破骨細(xì)胞分化中的作用,闡明肺癌溶骨性骨轉(zhuǎn)移的可能機制,為肺癌骨轉(zhuǎn)移患者“骨相關(guān)事件”的治療提供新的靶點。
　　方法:
　　首先檢測肺癌骨轉(zhuǎn)移患者轉(zhuǎn)移灶及癌旁組織標(biāo)本 Jagged1表達(dá),檢測 Jagged1對CD14+單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化、增殖的影響,并檢測Notch通路所起的作用。然后,收集A549 CM,檢測其對CD14+單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化、增殖的影響及Not

6、ch通路所起的作用。
　　一、Jagged1對CD14+單核細(xì)胞破骨分化、增殖的影響
　　免疫組織化學(xué)法檢測 Jagged1在肺癌骨轉(zhuǎn)移患者轉(zhuǎn)移灶和癌旁組織標(biāo)本中的表達(dá);Ficoll法聯(lián)合磁珠分選法分離純化人外周血CD14+單核細(xì)胞,CD14+單核細(xì)胞分為Control group、Jagged1 group、DAPT group,用含(人)巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating f

7、actor, M-CSF)的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),Jagged1 group加入Jagged1重組蛋白,DAPT group加入Jagged1重組蛋白及DAPT。實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)檢測破骨細(xì)胞標(biāo)志基因抗酒石酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)、組織蛋白酶 K

8、(Cathepsin K, CK)、降鈣素受體(Calcitonin receptor, CTR)及 Notch靶基因Hes-1(hairy and enhancer of split-1)、Hey-1(HES-related with YRPW motif-1) mRNA的表達(dá);TRAP染色鑒定所分化破骨細(xì)胞;掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy, SEM)檢測破骨細(xì)胞溶骨功能。CCK-8(Cell

9、 Counting Kit-8)法檢測各組CD14+單核細(xì)胞的增殖。
　　二、Notch通路在A549細(xì)胞條件培養(yǎng)液調(diào)控CD14+單核細(xì)胞破骨分化、增殖過程中的作用
　　CD14+單核細(xì)胞分為Control group、A549 CM group、DAPT group,用含M-CSF的α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng),A549 CM group加入10%A549 CM,DAPT group加入10%A549 CM及DAPT。qPCR

10、檢測TRAP、CK、CTR及Notch靶基因Hes-1、Hey-1mRNA的表達(dá);TRAP染色鑒定破骨細(xì)胞;SEM檢測破骨細(xì)胞溶骨功能;CCK-8法檢測CD14+單核細(xì)胞增殖。細(xì)胞免疫熒光法檢測Notch活性片段NICD的表達(dá)。
　　實驗結(jié)果:
　　第一部分 Jagged1促進(jìn) CD14+單核細(xì)胞破骨分化成熟,并抑制其增殖
　　一、Jagged1在肺癌骨轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本中高表達(dá),在癌旁組織低表達(dá)或無表達(dá);
　　二、Ja

11、gged1促進(jìn)CD14+單核細(xì)胞TRAP、CK、CTR mRNA的表達(dá);
　　三、Jagged1促進(jìn)CD14+單核細(xì)胞形成TRAP+多核細(xì)胞;
　　四、Jagged1增加CD14+單核細(xì)胞破骨分化及骨溶解;
　　五、Jagged1抑制CD14+單核細(xì)胞的增殖;
　　六、Jagged1增加CD14+單核細(xì)胞Notch靶基因Hes-1、Hey-1 mRNA的表達(dá)。
　　第二部分 A549 CM通過活化Notch

12、通路促進(jìn)CD14+單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化,而DAPT可促進(jìn)其促CD14+單核細(xì)胞增殖作用。
　　一、A549 CM活化Notch通路促進(jìn)CD14+單核細(xì)胞TRAP、CK、CTR mRNA的表達(dá);
　　二、A549 CM活化Notch通路促進(jìn)CD14+單核細(xì)胞形成TRAP+多核細(xì)胞;
　　三、A549 CM活化Notch通路促進(jìn)CD14+單核細(xì)胞破骨分化及骨溶解;
　　四、DAPT可增加A549 CM促進(jìn)CD14+

13、單核細(xì)胞增殖的能力;
　　五、A549 CM增加CD14+單核細(xì)胞Notch靶基因Hes-1、Hey-1 mRNA的表達(dá);
　　六、A549 CM促進(jìn)CD14+單核細(xì)胞NICD向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移。
　　結(jié)論:
　　Jagged1在肺癌骨轉(zhuǎn)移患者標(biāo)本中高表達(dá),在癌旁組織低表達(dá)或無表達(dá)。Jagged1/Notch通路促進(jìn) CD14+單核細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化且抑制其增殖。肺腺癌 A549細(xì)胞可通過活化 Notch通路促進(jìn) C