1、本實驗采用D-半乳糖致亞急性衰老的雌性大鼠模型，以細胞衰老信號轉導途徑中涉及的關鍵調(diào)節(jié)因子p53、p19ARF、Rb及p16等為介入點，從分子生物學角度探討何首烏飲對延緩下丘腦-垂體-卵巢軸(H-P-O-A)衰老的作用機制，并且通過檢測下丘腦、垂體、卵巢組織IGF-1、IGF-BP、TNF-α、EGF、EGFR的表達及電鏡超微結構變化等，從多層次、多環(huán)節(jié)闡明哺乳動物衰老機制，以及何首烏飲對下丘腦.垂體.卵巢軸的抗衰老作用。 1.

2、 目的 應用RT-PCR、Western blotting、原位雜交及免疫組化方法檢測衰老模型大鼠下丘腦、垂體、卵巢組織p53、p19ARF、Rb和p16、EGF、EGFR、TNF-α、IGF-I、IGFBP3的表達，并且從下丘腦、垂體和卵巢三個層次來觀察H-P-G-A衰老的組織學變化，以及何首烏飲對該軸的作用，從而探討大鼠性腺軸的衰老機制，分析何首烏飲抗衰老的作用。 2. 方法 2.1 實驗動物的選取、分組及模

3、型的建立：選用8周齡清潔級SD雌性大鼠96只隨機分為正常組、模型組、預防組。預防組又分為何首烏飲低劑量組、何首烏飲中劑量組、何首烏飲高劑量組、何首烏丸組，每組動物各16只。用6％的D-半乳糖溶液腹腔注射的方法連續(xù)用藥60d，建立亞急性衰老大鼠模型。預防組在腹腔注射D-半乳糖溶液的同時給藥何首烏飲、何首烏丸。 2.2 標本的采集及研究方法：連續(xù)用藥60d后，取各組大鼠的下丘腦、垂體前葉和卵巢新鮮組織，應用RT-PCR法檢測其p53

4、、p19ARF、Rb、p16及IGFBP3的基因水平，應用Western blotting方法檢測Rb及p16蛋白的表達。將各組大鼠用不同的固定液進行左心室灌注，最后取其下丘腦、垂體前葉、卵巢組織，應用免疫組化法檢測p53、EGF、EGFR、TNF-α蛋白的表達，應用原位雜交技術檢測IGF-I mRNA的水平，應用透射電鏡觀察下丘腦、垂體前葉及卵巢組織超微結構的變化。 3.結果 3.1 大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸p19AR

5、F/p53/p21Cip1和p16INK4a/Rb衰老途徑中關鍵調(diào)節(jié)因子發(fā)生改變，應用何首烏飲可糾正這些因子的過度表達： 3.1.1 PCR結果顯示，模型組大鼠下丘腦、垂體前葉、卵巢組織中p53基因表達明顯高于正常組(P<0.01)，給予不同劑量的何首烏飲預處理后，p53基因表達比模型組降低(P<0.05)。在下丘腦和垂體前葉，低劑量組p53基因表達低于何首烏丸組(P<0.05)；而在卵巢，高劑量組p53基因表達低于何首烏丸組(

6、P<0.05)。免疫組化結果顯示，模型組大鼠下丘腦弓狀核、垂體前葉、卵巢組織中p53的染色明顯強于正常組(P<0.01)，給予不同劑量的何首烏飲預處理后，p53染色比模型組降低(P<0.05)。在垂體前葉組織中，低劑量組p53染色弱于何首烏丸組(P<0.05)；而在卵巢組織中，高劑量組p53染色弱于何首烏丸組(P<0.05)。 3.1.2 PCR結果顯示，模型組大鼠下丘腦、垂體前葉、卵巢組織中p19ARF基因明顯升高(P<0.0

7、1)，給予不同劑量的何首烏飲預處理后，與模型組相比，p19ARF基因表達明顯降低(P<0.01，P<0.05)。在下丘腦，低劑量組p19ARF基因表達低于何首烏丸組(P<0.05)；而在卵巢，高劑量組p19ARF基因表達低于何首烏丸組(P<0.05)。 3.1.3 PCR結果顯示，模型組大鼠下丘腦、垂體前葉、卵巢組織中Rb基因表達明顯高于正常組(P<0.01)，給予不同劑量的何首烏飲預處理后，Rb基因表達明顯比模型組降低(P<0

8、.01，P<0.05)。在下丘腦和垂體前葉，低劑量組Rb基因表達低于何首烏丸組(P<0.05)；而在卵巢，高劑量組Rb基因表達低于何首烏丸組(P<0.05)。Western結果顯示，模型組大鼠下丘腦、垂體前葉、卵巢組織的Rb蛋白表達明顯高于正常組(P<0.05)，不同劑量的何首烏飲各組下丘腦、垂體前葉、卵巢組織的Rb蛋白表達明顯低于模型組(P＜0.05)。在垂體前葉，低劑量組Rb蛋白表達低于何首烏丸組(P＜0.05)；而在卵巢，高劑量組

9、Rb蛋白表達低于何首烏丸組(P＜0.05)。 3.1.4 PCR結果顯示，模型組大鼠下丘腦、垂體前葉、卵巢組織中p16基因表達明顯高于正常組(P＜0.01)，給予不同劑量的何首烏飲預處理后，p16基因表達比模型組降低(P＜0.01，P＜0.05)。在下丘腦，低劑量組p16基因表達低于何首烏丸組(P＜0.05)。Western結果顯示，模型組大鼠下丘腦、垂體前葉、卵巢組織的p16蛋白表達明顯高于正常組(P＜0.01，P＜0.05)，不同劑

10、量的何首烏飲各組大鼠下丘腦、垂體前葉、卵巢組織的p16蛋白表達明顯低于模型組(P＜<0.01，P＜0.05)。 3.2 大鼠下丘腦-垂體-卵巢軸衰老相關細胞因子的表達發(fā)生改變，應用何首烏飲可糾正這些因子的異常表達： 3.2.1 大鼠免疫組化結果顯示，衰老模型大鼠EGF在卵巢中的染色明顯弱于正常組(P＜0.01)，EGFR在下丘腦弓狀核、垂體前葉、卵巢中的染色亦明顯比正常組減弱(P＜0.01)。給予不同劑量的何首烏飲預處理

11、后，EGF及EGFR的染色比模型組增強(P＜0.01，P＜0.05)。 3.2.2 免疫組化結果顯示，與正常組相比，衰老模型大鼠TNF-α在下丘腦弓狀核、垂體前葉、卵巢中的染色明顯增強(P＜0.01)。給予不同劑量的何首烏飲預處理后，TNF-α染色明顯比模型組減弱(P＜0.01，P＜0.05)。在下丘腦弓狀核和垂體前葉，何首烏飲各組TNF-α的表達低于何首烏丸組(P＜0.05)。 3.2.3 原位雜交結果顯示，衰老模型大

12、鼠卵巢組織中IGF-I mRNA表達明顯低于正常大鼠(P＜0.01)，給予不同劑量的何首烏飲及何首烏丸預處理后，IGF-I mRNA表達比模型大鼠升高(P＜0.01)。PCR結果顯示，與正常組大鼠相比，模型組大鼠下丘腦、垂體前葉、卵巢組織中IGFBP3基因表達明顯上調(diào)(P＜0.01)，給予不同劑量的何首烏飲預處理后，IGFBP3基因表達明顯比模型組降低(P＜0.01，P＜0.05)。 3.3 衰老大鼠下丘腦弓狀核、垂體前葉、卵巢

13、的形態(tài)學發(fā)生損傷性改變，應用何首烏飲可減緩這種損傷： 3.3.1 下丘腦弓狀核形態(tài)學改變：光鏡下觀察，下丘腦弓狀核包括神經(jīng)元細胞和神經(jīng)膠質(zhì)細胞。在模型組，尚發(fā)現(xiàn)有大量反應膠質(zhì)細胞。透射電鏡下觀察，下丘腦弓狀核有暗細胞和亮細胞兩類神經(jīng)元。模型組可見核膜凹陷增多，核膜溶解；溶酶體增多；線粒體嵴斷裂、膜融合或消失；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒；高爾基體擴張。突觸前、后膜模糊不清，突觸間隙融合。預防各組可見部分核膜溶解；可見溶酶體；線粒體嵴部分斷裂

14、、膜部分模糊不清；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度脫顆粒；高爾基體輕度擴張。突觸前、后膜尚清晰，突觸間隙部分融合。 3.3.2 垂體前葉形態(tài)學改變：光鏡下觀察，垂體前葉腺細胞包括嗜酸性細胞和嗜堿性細胞和嫌色細胞。模型組可見腺細胞排列紊亂，血管增生、變性。嗜酸性細胞及嗜堿性細胞數(shù)量減少。透射電鏡下觀察，模型組垂體促性腺激素細胞可見核內(nèi)異染色質(zhì)增多，核膜部分溶解；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張明顯；高爾基體增多、擴張；線粒體腫脹，嵴斷裂、融合或消失；分泌顆粒增多。

15、 3.3.3 卵巢形態(tài)學改變：光鏡下觀察，可見各級卵泡及黃體。衰老模型大鼠卵巢中原始卵泡、生長卵泡及黃體均明顯少于正常大鼠(P<0.05，P<0.01)。各級卵泡顆粒細胞層次減少，細胞排列紊亂，囊性擴張的卵泡增多?？梢婎w粒細胞小巢或條索，尚可見炎細胞浸潤。預防各組大鼠卵巢中原始卵泡、生長卵泡及黃體多于模型大鼠(P<0.05，P<0.01)。透射電鏡下觀察，模型組可見細胞內(nèi)線粒體減少，呈不同程度的腫脹，嵴部分斷裂甚至消失；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

16、不豐富，輕度擴張；高爾基體肥大。何首烏飲低劑量組可見線粒體擴張顯著；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度擴張；高爾基復合體擴張；脂滴增多，體積較大。何首烏飲中劑量組可見線粒體數(shù)目增多，體積增大，部分線粒體腫脹，核膜擴張；胞質(zhì)內(nèi)脂滴較多。何首烏飲高劑量組可見細胞結構接近于正常組，線粒體豐富；胞漿中脂滴電子密度高；滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；有豐富的高爾基復合體。何首烏丸組可見線粒體數(shù)目增多，體積增大，部分線粒體腫脹，核膜擴張；胞質(zhì)內(nèi)脂滴較多。 4.結論 1

17、.衰老模型大鼠H-P-O-A性腺軸p19ARF/p53/p21Cipl和p16INK4a/Rb衰老途徑中關鍵的調(diào)節(jié)因子p19ARF、p53、Rb、p16基因及蛋白表達上調(diào)，預防性應用何首烏飲對此可以起到抑制作用。 2.衰老模型大鼠H-P-O-A性腺軸衰老相關細胞因子EGF及其受體EGFR、IGF-I及其結合蛋白IGFBP3表達均降低，預防性應用何首烏飲可增加這些細胞因子的表達。 3.衰老模型大鼠H-P-O-A性腺軸衰老相