1、背景：
　　由于當(dāng)今社會(huì)正朝著老齡化社會(huì)不斷演變，因此關(guān)注老齡化相關(guān)疾病的研究顯得格外重要。心血管循環(huán)系統(tǒng)是維持人體正常生命活動(dòng)的重要組成部分，然而心臟的再生能力十分有限，隨著年齡的增長，心臟的收縮舒張功能逐漸衰退，這使得心臟逐漸難以維持其正常的泵血功能。因此，延長心臟衰老，維持心臟收縮舒張的泵血功能成為一個(gè)十分有意義的研究方向。
　　研究表明，心臟衰老的發(fā)病機(jī)制涉及多個(gè)分子機(jī)制，包括氧化應(yīng)激、自噬障礙，代謝變化，鈣平衡調(diào)節(jié)

2、障礙，和神經(jīng)內(nèi)分泌通路的激活等。心肌細(xì)胞終末分化的性質(zhì)使得這些細(xì)胞內(nèi)受損的大分子和細(xì)胞器特別容易積累，這就意味著需要增加自噬的激活來清理這些有害細(xì)胞的“垃圾”，以維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。不幸的是，心肌細(xì)胞自噬活性隨著年齡的增長而下降，而細(xì)胞自噬的受損具有多重不良后果，包括降低心臟收縮功能和增加心律失常的風(fēng)險(xiǎn)等。隨著年齡的增長，心臟中活性氧(reactive oxygen species ROS)的含量也隨之增加，老化的心肌細(xì)胞內(nèi)的ROS主要由受

3、損的線粒體所產(chǎn)生的，與此同時(shí)ROS的異常蓄積亦會(huì)引起線粒體損傷，最終導(dǎo)致細(xì)胞的凋亡。由此可見線粒體是ROS生成的主要來源細(xì)胞器同時(shí)也是ROS攻擊的靶細(xì)胞器。由于心肌細(xì)胞對(duì)線粒體能量代謝的高度依賴性，使得心臟在整個(gè)生命周期內(nèi)都暴露在ROS的高負(fù)荷中。所以在一定程度下清除ROS，即抗氧化作用是延緩心臟衰老的有效措施。
　　線粒體自噬是一個(gè)高度選擇的自噬過程，可以促進(jìn)清除功能障礙或不必要的線粒體。PINK1-Parkin通路是當(dāng)下研究中

4、較為受到關(guān)注的線粒體自噬途徑。當(dāng)線粒體膜電位消失，則導(dǎo)致PINK1穩(wěn)定地在線粒體外膜存在，之后則會(huì)促進(jìn)胞內(nèi)E3泛素連接酶Parkin的招募和激活。激活的Parkin可以介導(dǎo)功能障礙的線粒體被自噬體吞噬以進(jìn)而被選擇性消除。因而通過激活PINK1和Parkin的線粒體自噬可以防止受損線粒體對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)一步損傷，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而延緩心臟衰老。
　　熱休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一類生物體中組織結(jié)構(gòu)高度保守

5、的蛋白質(zhì)，細(xì)胞可以由內(nèi)源或者外源性應(yīng)激源的刺激下誘導(dǎo)產(chǎn)生。熱休克蛋白27(HSP27)是一種廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物的小熱休克蛋白亞家族的成員，在人類，其分子量為27 kDa，在嚙齒類動(dòng)物中，其分子量為25 kDa。HSP27除了在細(xì)胞分子水平上使錯(cuò)誤結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)完成正確的折疊和組裝，通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖，分化，凋亡外，還參與了組織在氧化應(yīng)激、熱休克反應(yīng)、缺氧/缺血損傷等的調(diào)控。我們研究組和其他研究人員均發(fā)現(xiàn)高表達(dá)HSP27可以對(duì)抗缺

6、血/再灌注損傷，心肌梗死，炎癥反應(yīng)，以及阿霉素誘導(dǎo)的心臟損傷，心功能障礙。HSP27對(duì)心臟保護(hù)的機(jī)制涉及抗氧化能力，抑制炎癥反應(yīng)，提高心肌細(xì)胞的存活率，以及自噬激活和提高線粒體活性等。因此，我們提出研究假設(shè):高表達(dá)HSP27可以延緩由增齡引起的心臟衰老。
　　目的：
　　在本項(xiàng)研究中，我們通過構(gòu)建在心臟特異表達(dá)HSP27的轉(zhuǎn)基因小鼠（Tg），同時(shí)選取年齡與之相匹配的野生型小鼠(WT)作為衰老模型的研究對(duì)象來探索HSP27對(duì)由

7、年齡誘導(dǎo)的心臟衰老的作用及其可能涉及的機(jī)制。
　　研究方法和內(nèi)容：
　　1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的構(gòu)建
　　在南京大學(xué)動(dòng)物模式所的協(xié)助下，構(gòu)建心肌特異性表達(dá)的HSP27轉(zhuǎn)基因小鼠(Tg)，本研究以飼養(yǎng)2年（24個(gè)月）的Tg小鼠和性別，年齡與之相匹配的野生型小鼠(WT)作為衰老模型的研究對(duì)象。本實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)報(bào)告均得到了南京大學(xué)動(dòng)物保護(hù)委員會(huì)的批準(zhǔn)。所有實(shí)驗(yàn)均遵守關(guān)于動(dòng)物倫理使用的國際準(zhǔn)則。
　　2.小鼠心功能的檢測

8、
　　通過Vev0770設(shè)備對(duì)小鼠進(jìn)行超聲心動(dòng)圖測量。在超聲心動(dòng)圖測量時(shí)，2個(gè)月月齡的Tg小鼠和性別相匹配的WT小鼠作為青年對(duì)照組。通過M-mode型超聲評(píng)價(jià)小鼠射血分?jǐn)?shù)等心功能指標(biāo)，或著通過脈沖多普勒評(píng)價(jià)二尖瓣功能。最終的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為至少連續(xù)五個(gè)心動(dòng)周期的平均值。
　　3.馬松三色染色
　　將心臟組織收集后，用4％多聚甲醛過夜固定，之后用石蠟包埋，在乳頭肌水平制作成石蠟切片。馬松三色染色法是用來了解心臟纖維化程度的方法

9、。染色后的片子在放大400 x的顯微鏡下觀察，通過計(jì)算心室中心肌內(nèi)纖維化的面積比例來評(píng)價(jià)小鼠心肌纖維化的程度。
　　4.組織免疫熒光
　　收集好小鼠心臟組織標(biāo)本，用4％多聚甲醛過夜固定，之后用石蠟包埋組織制作成切片后，將切片進(jìn)行脫蠟、水化，抗原修復(fù)和封閉。隨后，將切片上的組織與適當(dāng)?shù)囊豢乖?℃孵育過夜，第二天選用FITC（綠色熒光）或者Cy3（紅色熒光）標(biāo)記的二抗在37℃孵育60min。用α-actinin來表示心肌細(xì)胞。用

10、Hoechst33342對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染。染色后切片的觀察和圖像的采集通過熒光顯微鏡來完成。
　　5.DCFH檢測
　　通過熒光指示劑DCFH來測定ROS水平。當(dāng)把DCFH加到組織勻漿中，勻漿中ROS會(huì)使得DCFH氧化，生產(chǎn)熒光的DCF。將1uM的DCFH和1毫升含10ug心肌胞漿蛋白一起孵育1h后，使用900Hi型全自動(dòng)恒溫酶標(biāo)儀在485nm的激發(fā)波長和535nm的發(fā)射波長下進(jìn)行檢測。
　　6.蛋白羰基化實(shí)驗(yàn)

11、　　將心室組織在（蔗糖0.3M，煙堿0.03M和EDTA0.02M，pH7.4）液體里勻漿，之后將組織勻漿液在4℃離心機(jī)中以10000g離心5 min。每500ul體積中含100ug的胞漿蛋白，和2mM的DNPH常溫避光孵育1h。最后將DNPH處理的蛋白，采用Western blot的方法檢測蛋白質(zhì)的羰基化反應(yīng)。
　　7.蛋白質(zhì)印跡
　　收集24個(gè)月大的老齡小鼠心臟，提取蛋白通過Western blot的方法檢測p16，p5

12、3，LC3，p62，PINK1，Parkin等蛋白水平。GAPDH作為蛋白質(zhì)印跡的內(nèi)參，每組n=3。
　　8.統(tǒng)計(jì)分析
　　所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間比較采用t檢驗(yàn)或者單因素方差分析，數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　研究結(jié)果：
　　1.HSP27減輕由年齡引起的心臟衰老
　　1.1心肌特異性表達(dá)HSP27的鑒定
　　我們成功構(gòu)建心肌特異性表達(dá)人

13、HSP27基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過Westernblot分析來確認(rèn)，在Tg小鼠心臟中HSP27表達(dá)豐富，而野生型對(duì)照組中則不表達(dá)（HSP27抗體不與小鼠的HSP25交叉反應(yīng)）。
　　1.2 HSP27對(duì)衰老心臟心功能的影響
　　與年輕的WT小鼠相比，老年的WT小鼠的E/A比值減少37.5％，EF(40.0％)和FS(45.9％)明顯下降，與此同時(shí)LVVd(67.4％)和LVVs(181.0％)明顯增加(P＜0.01)。與年輕的

14、Tg小鼠相比，老年Tg小鼠的E/A比值減少15.4％(P＜0.05)，而老年Tg小鼠的EF，F(xiàn)S，和LVVd較年輕Tg小鼠相比變化不大。但是，與老齡WT小鼠相比，老齡Tg小鼠減緩(37.4％)由于年齡引起的E/A比值減少(P＜0.05)，高齡Tg小鼠較WT小鼠EF、FS明顯增加，同時(shí)LVVd和LVVs明顯降低(P＜0.01)。
　　2.HSP27減少老年小鼠心肌中衰老標(biāo)志物的水平
　　在小鼠心肌組織中，與老年WT小鼠相比，老

15、年Tg小鼠的p16和p53的水平分別顯著降低46.5％和49.4％（P＜0.01），老年Tg小鼠的p21表達(dá)水平比WT老年小鼠心肌中p21的表達(dá)水平顯著降低(P＜0.01)。為了確定p53的激活，我們繼續(xù)探究在Ser15位點(diǎn)磷酸化的p53磷酸化水平(p-p53)。在老齡Tg小鼠心臟的p-p53水平比老齡WT小鼠心肌組織中的p-p53明顯降低（P＜0.01）。
　　3.HSP27減緩老年小鼠心肌間質(zhì)的纖維化進(jìn)程
　　與老齡WT

16、小鼠心臟心肌間質(zhì)相比，老年Tg小鼠心臟心肌間質(zhì)纖維化明顯減少76.2％(P＜0.01)。
　　4.HSP27減少老年小鼠心肌中ROS的含量
　　在老齡的WT小鼠和Tg小鼠的心臟中ROS含量分別為2038.6和752.4個(gè)單位，老年Tg小鼠的心臟中ROS含量比老年的WT小鼠顯著降低(P＜0.01)。同時(shí)，老齡Tg小鼠心肌的蛋白質(zhì)羰基化水平(46.1％)明顯較老齡的WT小鼠降低（P＜0.01）
　　5.HSP27提高老齡小

17、鼠心臟中的自噬水平
　　與老齡WT小鼠心臟相比，老年Tg小鼠心臟的LC3-Ⅱ蛋白水平明顯降低38.7％(P＜0.01)，p62蛋白表達(dá)水平降低59％(P＜0.01)。同時(shí)老齡Tg小鼠心臟中參與自噬體形成和成熟的蛋白表達(dá)水平較WT高齡小鼠顯著增加:Atg13(112.7％)、Vps34(68.5％)、和Rab7(138.4％)(P＜0.01)。
　　6.HSP27減少泛素結(jié)合蛋白的含量
　　高齡的Tg小鼠心臟的蛋白質(zhì)的泛

18、素化水平(76.2％)比高齡的WT小鼠顯著降低(P＜0.01)。
　　7.HSP27增加PINK1和Parkin在老齡心臟中的表達(dá)水平
　　與老齡的WT小鼠心臟相比，老齡Tg小鼠心臟中PINK1和Parkin的表達(dá)水平分別增加了57.1％和60.5％(P＜0.01)，高齡Tg小鼠心臟中BNIP3表達(dá)水平明顯高于高齡WT小鼠(P＜0.05)。而Nix蛋白的水平在兩組基因型不同的高齡小鼠中表達(dá)相差不大。
　　結(jié)論：