1、血管通透性增高是燒傷早期休克和臟器水腫的根本原因，其本質是血管內皮屏障通透性的增高，從而導致早期血管內液大量外滲，引發(fā)全身組織灌注減少和組織器官水腫。由于燒傷早期血管通透性增高機制尚未得到充分證實，目前臨床上缺少有效的防治措施。因此，深入揭示燒傷后微血管通透性變化的分子調節(jié)機制，研究防治微血管滲漏和燒傷休克的新型策略，具有重要的理論價值和臨床意義。
　　內皮細胞回縮是多種病理生理（包括燒傷）條件下內皮細胞間裂隙形成、微血管通透性增

2、高的重要基礎。以往認為，應力纖維中F-actin與肌球蛋白相互作用，產生向心收縮力，是內皮細胞回縮的骨架基礎，而HSP27磷酸化則是應力纖維形成的重要分子機制。然而，最近有研究發(fā)現，磷酸化HSP27通過促進應力纖維形成或保護F-actin骨架，顯著降低了缺氧或急性炎癥等條件下血管內皮通透性。
　　p38激酶/MK2是HSP27磷酸化的關鍵信號途徑。我們以往發(fā)現，燒傷后血管內皮通透性增高并不與應力纖維形成相平行。燒傷后內皮細胞F-a

3、ctin骨架發(fā)生了復雜變化，即:早期形成應力纖維，后期F-actin破壞、解聚或排列紊亂。我們前期預實驗結果顯示，燒傷血清刺激條件下內皮細胞HSP27磷酸化水平僅短暫升高。鑒于磷酸化HSP27降低血管通透性作用的相關認識，我們推測，p38激酶-HSP27磷酸化很可能是燒傷后血管內皮屏障的重要保護性適應機制，只是隨著時間延長，促通透性因素的級聯放大，p38激酶-HSP27磷酸化這一保護性適應機制不斷削弱，使得血管通透性增高。
　　本

4、項目提出HSP27磷酸化是燒傷后血管內皮屏障的重要保護性適應機制的假設。擬以燒傷患者血清為刺激因素，以大鼠微血管內皮細胞為對象，采用基因突變技術構建磷酸化和非磷酸化HSP27表達突變體，探討HSP27的磷酸化狀態(tài)與燒傷血清刺激條件下肺血管內皮細胞應力纖維形成和通透性變化的關系;從蛋白磷酸酶PP2A調節(jié)HSP27去磷酸化和SUMO化修飾對MK2活性的抑制作用兩方面，初步明確HSP27磷酸化隨時間削弱的分子機制。研究對深入揭示燒傷后微血管通

5、透性變化的分子調節(jié)機制，從細胞內源性保護角度促成防治微血管滲漏和燒傷休克的新型策略，具有重要意義。
　　研究目的：
　　探討磷酸化HSP27在燒傷血清刺激誘導血管內皮通透性變化中的作用及其調節(jié)機制。
　　研究內容：
　　1.HSP27磷酸化、蛋白表達和分布與內皮細胞應力纖維形成、通透性變化關系的研究
　　2.HSP27磷酸化在燒傷血清刺激誘導血管內皮通透性變化中的作用
　　3.PP2A與MK2的SUM

6、O化修飾對HSP27磷酸化的調節(jié)作用研究
　　研究方法：
　　1.按常規(guī)方法收集嚴重燒傷患者血清（深二度和三度燒傷面積＞50％的患者）
　　2.培養(yǎng)大鼠肺微血管內皮細胞，利用Transwell小室建立單層內皮細胞通透性實驗模型，采用跨單層內皮細胞電阻法(TEER)評估內皮單層通透性變化。
　　3.采用細胞免疫熒光化學染色技術觀察內皮細胞ZO-1、F-actin形態(tài)分布變化;采用Image J軟件計算內皮細胞間隙和

7、細胞表面積變化。
　　4.采用Western blot技術檢測燒傷血清刺激條件下內皮細胞p38激酶、MK2和HSP27磷酸化水平以及MK2的SUMO化修飾。
　　5.構建磷酸化、非磷酸化和野生型HSP27腺病毒高表達載體，并成功轉染內皮細胞。
　　6.采用OA抑制PP2A和轉染SENP1腺病毒抑制MK2的SUMO化修飾，探討PP2A去磷酸化作用和SUMO化修飾抑制MK2活性對HSP27磷酸化的調節(jié)作用。
　　研究

8、結果與結論：
　　1.燒傷血清刺激1h，肺微血管內皮細胞通透性顯著增強，隨著刺激時間延長，通透性進一步增強;同時，細胞間緊密連接完整性破壞，伴細胞間裂隙增加和細胞表面積縮小。
　　2.燒傷血清刺激0.5h，內皮細胞中央型F-actin應力纖維形成增多;隨著刺激時間延長，中央型F-actin應力纖維消失，代之以不規(guī)則的細胞周邊型F-actin形成增多。
　　3.燒傷血清使p38 MAPK-MK2-HSP27信號通路激活;

9、其中，p38 MAPK/MK2呈持續(xù)活化，而HSP27磷酸化僅在燒傷血清刺激0.5h時大幅增強，隨后迅速回落。HSP27磷酸化瞬時增強與內皮細胞應力纖維形成時間相吻合，二者高峰均出現于內皮細胞通透性增高之前。
　　4.構建的磷酸化、非磷酸化和野生型HSP27腺病毒高表達載體能有效轉染內皮細胞并高表達目的蛋白。較之非磷酸化HSP27和空載體轉染對照組，磷酸化HSP27轉染能顯著抑制燒傷血清導致的內皮細胞高通透性，使細胞中央型F-ac

10、tin應力纖維形成增多。此外，磷酸化HSP27可以部分對抗細胞松弛素D導致的內皮通透性增高。
　　5.內皮細胞PP2A可與HSP27發(fā)生相互作用，且這一作用在燒傷血清刺激條件下進一步增強，抑制PP2A可使燒傷血清刺激條件下內皮細胞HSP27磷酸化部分增強。內皮細胞中MK2存在SUMO化修飾，且該修飾作用在燒傷血清刺激條件下進一步增強。高表達SENP1可顯著解除SUMO蛋白對MK2活性的抑制作用，使HSP27的磷酸化水平升高。