1、目的：研究survivin、c-Myc蛋白在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，Rb)組織中的表達(dá)，探討Rb中survivin與c-Myc蛋白的表達(dá)及與瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)系；體外觀察曲古菌素A(trichostatin A，TSA)誘導(dǎo)人Rb細(xì)胞株Hxo-rb44的細(xì)胞周期阻滯和凋亡的作用，以及TSA對(duì)凋亡抑制蛋白survivin和原癌基因c-Myc表達(dá)變化的影響；構(gòu)建針對(duì)survivin蛋白的shRNA(short hairpi

2、n RNA,短發(fā)夾RNA)表達(dá)質(zhì)粒，觀察其對(duì)人Rb細(xì)胞株Hxo-rb44細(xì)胞的survivin及c-Myc蛋白表達(dá)的抑制作用，以及對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，為探討shRNA-survivin應(yīng)用于Rb的基因治療提供理論基礎(chǔ)。
　　 方法：(1)華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院眼科1994年12月至2005年8月期間的接受眼球摘除術(shù)的Rb病人23例23只眼，用免疫組織化學(xué)的Sp法(streptavidin-peroxidase conj

3、unct method,鏈霉親和素-過氧化物酶連接法)檢測survivin、c-Myc蛋白在這23例Rb組織中的表達(dá)；用TUNEL技術(shù)(terminal deoxynucleo-tidyl transferase-mediate deoxyuridinetriphosphate nick end labeling，TdT-mediated d-UTP nick end labeling，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的脫氧尿苷三磷酸缺口末端標(biāo)

4、記技術(shù))檢測Rb組織中的瘤細(xì)胞凋亡情況。(2)對(duì)人Rb細(xì)胞株Hxo-rb44進(jìn)行培養(yǎng)傳代，用流式細(xì)胞儀檢測不同濃度的TSA作用不同時(shí)間后對(duì)Hxo-rb44細(xì)胞株之細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響，用Western blot(蛋白質(zhì)免疫印跡)法檢測凋亡過程中survivin和c-Myc蛋白表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化。(3)設(shè)計(jì)合成一對(duì)針對(duì)人survivin的mRNA寡核苷酸序列，退火后將其連入載體，對(duì)重組質(zhì)粒pSIREN進(jìn)行酶切鑒定；用脂質(zhì)體介導(dǎo)的方法將干擾

5、質(zhì)粒pSIREN轉(zhuǎn)染Hxo-rb44細(xì)胞，用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染對(duì)survivin、c-Myc蛋白表達(dá)的影響，用Hoechst33258染色法檢測轉(zhuǎn)染前后的Hxo-rb44細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡率，并繪制出細(xì)胞生長曲線。
　　 結(jié)果：(1)在23例23只眼Rb組織切片中，survivin蛋白陽性表達(dá)率為60.9％(14/23)，可見陽性部位位于胞漿；c-Myc蛋白陽性表達(dá)率為73.9％(17/23)，可見陽性部位位于胞核。平

6、均凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)為0.52[％]。Survivin蛋白表達(dá)與Rb瘤細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與c-Myc蛋白表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(p<0.05)。(2)TSA可明顯誘導(dǎo)Rb細(xì)胞周期阻滯在G2期并誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生，而且與藥物濃度呈依賴關(guān)系；用Western blot法可以觀察到survivin和c-Myc蛋白表達(dá)水平隨著TSA作用時(shí)間的延長而顯著下降。(3)酶切證實(shí)目的寡核苷酸片段已經(jīng)被克隆到pSIREN，

7、轉(zhuǎn)染pSIREN質(zhì)粒可以顯著抑制瘤細(xì)胞的survivin蛋白表達(dá)；細(xì)胞凋亡率由3.5±1.29％上升到36.1±19.66％，c-Myc蛋白表達(dá)也顯著下降，瘤細(xì)胞生長受抑制。轉(zhuǎn)染對(duì)照質(zhì)粒對(duì)細(xì)胞survivin、c-Myc蛋白及凋亡均無明顯影響。
　　 結(jié)論：(1)survivin和c-Myc蛋白在Rb協(xié)同高表達(dá)的現(xiàn)象，可能在Rb的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮抗凋亡促增殖的重要作用。(2)TSA可以有效誘導(dǎo)人Rb細(xì)胞株Hxo-rb44的細(xì)胞