1、人臍血源基質(zhì)細胞(human umbilical cord blood derived stromal cells，hUCBDSCs)是我科從2001年開始，在多項國家自然科學基金資助下率先從人臍帶血中分離培養(yǎng)出并已被國內(nèi)外認可的一種基質(zhì)細胞。
　　 在對造血微環(huán)境功能的系列研究中發(fā)現(xiàn)，以hUCBDSCs為滋養(yǎng)層的體外擴增體系對人臍血CD34+造血干細胞具有明顯的擴增作用，體外與hUCBDSCs共培養(yǎng)擴增后的人臍血CD34+造血

2、干細胞集落形成能力明顯增強；對促進巨核細胞集落形成單位(CFU-Mg)的形成具有明顯優(yōu)勢。動物實驗研究結(jié)果進一步顯示，hUCBDSCs經(jīng)尾靜脈輸注可迅速歸巢至小鼠骨髓并能長期生存；在對裸鼠造血損傷修復的研究中，發(fā)現(xiàn)hUCBDSCs具有促進造血損傷修復的作用。在體外研究中發(fā)現(xiàn)hUCBDSCs對促進巨核細胞集落的形成作用比入骨髓基質(zhì)細胞更加明顯后，進一步在造血微環(huán)境損傷裸鼠模型中，植入巨核系Hel細胞和人臍血源基質(zhì)細胞，發(fā)現(xiàn)人臍血源基質(zhì)細胞

3、在體內(nèi)促進巨核系細胞增殖和修復造血微環(huán)境都要強于人骨髓源基質(zhì)細胞。以上研究提示人臍血源基質(zhì)細胞在促進造血方面較骨髓源基質(zhì)細胞具有一定穩(wěn)定性和一定優(yōu)勢，對造血微環(huán)境損傷具有修復作用。相對于骨髓而言，人臍帶血來源廣泛，獲取方便，不受道德倫理限制。因此，人臍血源基質(zhì)細胞的發(fā)現(xiàn)為臨床上放/化療、造血干細胞移植后或其它血液性疾病改善造血微環(huán)境和促進造血恢復帶來了新前景。但是，人臍血源基質(zhì)細胞對促進造血干細胞向紅系、粒系、單核系、巨核系、淋巴系分化

4、的具體作用究竟如何，還沒有相關(guān)文獻報道，需要進一步研究。
　　 目前，在對基質(zhì)細胞和間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)的認識上，存在很大的爭議，引起爭議的主要原因是這兩類細胞自身缺乏特定的分子標記。根據(jù)對人臍血源基質(zhì)細胞的研究工作和認識，認為基質(zhì)細胞和間充質(zhì)干細胞是同一起源，不同發(fā)育階段的兩類細胞。這兩類細胞在細胞生物學特性及其造血調(diào)控作用有無差異，有必要進行系統(tǒng)的比較研究。
　　 據(jù)

5、此，本課題擬通過比較人臍血源基質(zhì)細胞和人臍血源間充質(zhì)干細胞體外有關(guān)生物學特點及其對人臍血CD34+造血干細胞的粘附率、遷移率；對人臍血CD34+造血干細胞誘導分化作用等方面探討來揭示人臍血源基質(zhì)細胞和間充質(zhì)干細胞體外支持、調(diào)控造血作用的特點，以豐富對人臍血源基質(zhì)細胞和間充質(zhì)干細胞的全面認識，為今后人臍血源基質(zhì)細胞的臨床科學應用提供理論和實驗依據(jù)。
　　 方法：
　　 (一)人臍血源間充質(zhì)干細胞和人臍血源基質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)

6、及其細胞生物學特性的比較
　　 1.人臍血源間充質(zhì)干細胞(hUCBDMSCs)和人臍血源基質(zhì)細胞(hUCBDSCs)的體外分離培養(yǎng)。健康嬰兒(足月胎齡)臍帶血在4小時內(nèi)經(jīng)6%的明膠沉降紅細胞后，用1.077g/l的Percoll淋巴細胞分離液，密度梯度離心獲得單個核細胞(mononuclear cell，MNC)。所得單個核細胞分別在改良Dexter體系培養(yǎng)hUCBDSCs，在間充質(zhì)干細胞專門培養(yǎng)基(mesenchymal st

7、em cell medium，MSCM)培養(yǎng)hUCBDMSCs。
　　 2.倒置顯微鏡下觀察兩類細胞的形態(tài)、貼壁、集落形成，細胞伸展及融合情況；采用CCK-8法和Transwell法分別檢測兩類細胞的體外增殖、粘附和對hUCB-MNCs遷移的影響：兩類細胞周期及細胞表面抗原的流式檢測(細胞表面抗原選擇：Fn、Lm、CD45、CD29、CD44、CD34、Stro-1和CD106)。
　　 3.兩類細胞向成骨、成脂、成軟骨

8、細胞誘導分化的檢測。用茜素紅染色檢測成骨情況，用油紅染色檢測成脂情況，用阿辛藍染色檢測成軟骨情況。
　　 (二)人臍血源間充質(zhì)干細胞和人臍血源基質(zhì)細胞體外調(diào)節(jié)造血干細胞作用的比較
　　 1.分別以兩種細胞為滋養(yǎng)層細胞，對人臍血單個核細胞短期共培養(yǎng)后，行半固體培養(yǎng)法比較CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM形成情況，未行共培養(yǎng)的造血干細胞為對照組。
　　 2.用逆轉(zhuǎn)錄PCR和實時定量熒光PCR方法檢測兩類細胞中

9、G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF細胞因子基因的表達。
　　 3.用ELISA法測定造血干細胞分別與兩類細胞共培養(yǎng)0、7、14天不同時相點，上清液中G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF細胞因子分泌變化情況。
　　 4.將用免疫磁珠分離法所得的臍血CD34+造血干細胞分別與hUCBDSCs和hUCBDMSCs共培養(yǎng)，用流式細胞儀于共培養(yǎng)第7、14天測定CD34+造血干細胞分別向粒系、紅系、

10、巨核系和淋巴系分化的情況。粒系選用的細胞標記：CD14、CD15、CD33；紅系選用的細胞標記：CD71；巨核系選用的細胞標記：CD41a；淋巴系選用的細胞標記：CD3、CD19。CD34+造血干細胞變化的檢測標記仍選用CD34。
　　 結(jié)果：
　　 (一)人臍血源間充質(zhì)干細胞和人臍血源基質(zhì)細胞的分離培養(yǎng)及其細胞生物學特性的比較
　　 1.人臍血源間充質(zhì)干細胞(hUCBDMSCs)和人臍血源基質(zhì)細胞(hUCBDS

11、Cs)的分離培養(yǎng)
　　 所獲得臍血體積50-100ml，平均每份84ml，臍血所含細胞數(shù)平均為2.3×109/ml，經(jīng)密度梯度離心能分離出的單個核細胞數(shù)平均為7.0×105/ml。每份臍血均可培養(yǎng)出hUCBDSCs，約67%的臍血可培養(yǎng)出HUCBDMSCs。
　　 2.hUCBDSCs和hUCBDMSCs鏡下形態(tài)觀察、細胞增殖、遷移、細胞周期及細胞表面抗原檢測
　　 臍血源單個核細胞在改良Dexter體系培養(yǎng)hU

12、CBDSCs，3-4天后，粘附在瓶壁的細胞形態(tài)有圓形、三角形、紡錘形和不規(guī)則形，培養(yǎng)7天后貼壁細胞主要由巨核樣、纖維樣和小球樣細胞組成。用同一放大倍數(shù)在不同視野分類和計數(shù)細胞，巨核樣細胞約占48%，纖維樣細胞約占44%，小球樣細胞約占8%，細胞融合達80%需30多天。在培養(yǎng)過程中無集落形成，按1:2的比例傳代，傳代能力差，最多傳到第3代。傳代后細胞仍為異形性，隨著傳代增加，細胞伸展和融合都明顯延遲。傳代后前4天細胞處于靜息期，4天后開始

13、呈對數(shù)性生長，在第8天達到細胞增殖最高峰，隨后增殖能力慢慢下降并進入一個平臺期。
　　 臍血源單個核細胞在MSCM培養(yǎng)基中培養(yǎng)hUCBDMSCs，在培養(yǎng)前7天，貼壁細胞形態(tài)以紡錘形、三角形和小球形多見，但培養(yǎng)10天后，一些纖維樣/紡錘體樣細胞逐漸長成濃密的集落，并開始快速生長，其它形態(tài)細胞逐漸消失，細胞形態(tài)趨于同一性，約28天細胞可長滿培養(yǎng)瓶，可按1:3的比例傳代，大約每5-7天傳代1次，可連續(xù)快速擴增細胞12代，細胞形態(tài)同原代

14、相同無變化。大約每1×108臍血單個核細胞可形成5個纖維樣集落。傳代后前2天細胞處于靜息期，2天后開始呈對數(shù)性生長，在第4天達到細胞增殖最高峰，隨后增殖能力下降并進入一個平臺期。
　　 Transwell法檢測兩類細胞對等量臍血源MNC的遷移，hUCBDMSCs組的膜下遷移細胞數(shù)：152±37，hUCBDSCs組的膜下遷移細胞數(shù)為237±22，經(jīng)配對樣本t檢驗p=0.03。
　　 hUCBDMSCs細胞周期檢測，G0/G

15、1期占86.34%，S期占4.14%，G2+M期占9.61%。hUCBDSCs細胞周期檢測：G0/G1期占76.18％，S期占9.87％，G2+M期占13.94％。
　　 hUCBDSCs和hUCBDMSCs都表達Fn、CD44和Stro-1，都不表達CD34。hUCBDMSCs表達Lm和CD29，但hUCBDSCs不表達。hUCBDSCs表達CD45和CD106，hUCBDMSCs不表達。
　　 3.hUCBDSCs和

16、hUCBDMSCs向成骨、成脂、成軟骨細胞誘導分化的檢測
　　 hUCBDMSCs可成功誘導向成骨、成脂、成軟骨分化，hUCBDSCs不能向成骨、成脂、成軟骨誘導分化。
　　 (二)人臍血源間充質(zhì)干細胞和人臍血源基質(zhì)細胞體外調(diào)節(jié)造血干細胞作用的比較
　　 1.人臍血單個核細胞分別與hUCBDSCs和hUCBDMSCs短期共培養(yǎng)后，行半固體培養(yǎng)基培養(yǎng)比較CFU-GM、CFU-E和CFU-GEMM形成情況
　　

17、 人臍血單個核細胞分別與hUCBDSCs和hUCBDMSCs短期共培養(yǎng)5天后，以hUCBDSCs為滋養(yǎng)層共培養(yǎng)的造血干細胞形成CFU-GM數(shù)高于以hUCBDMSCs為滋養(yǎng)層組，p<0.01。以hUCBDMSCs為滋養(yǎng)層共培養(yǎng)的造血干細胞形成CFU-GEMM數(shù)高于以hUCBDSCs為滋養(yǎng)層組，p<0.05。CFU-E形成數(shù)二者無顯著性差異。
　　 2.hUCBDSCs和hUCBDMSCs中G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和

18、GM-CSF細胞因子基因的表達的PCR檢測
　　 hUCBDSCs表達G-CSF基因高于hUCBDMSCs，而hUCBDMSCs表達TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF基因要高于hUCBDSCs的表達。
　　 3.用ELISA法測定造血干細胞分別與兩類細胞共培養(yǎng)0、7、14天不同時相點，上清液中G-CSF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF細胞因子分泌變化
　　 經(jīng)ELISA檢測，上清液中細胞因子G-C

19、SF、TPO、SCF、SDF-1和GM-CSF呈動態(tài)的分泌變化。在培養(yǎng)的0天，hUCBDSCs組上清中G-CSF的含量高于hUCBDMSCs組，SCF含量低于hUCBDMSCs組。TPO、GM-CSF和SDF-1的含量兩組相當無統(tǒng)計學意義，p>0.05。兩組都有細胞因子G-CSF、SCF、SDF-1在共培養(yǎng)第7天下降，在第14天上升的表現(xiàn)。TPO則在兩組共培養(yǎng)14天中都表現(xiàn)為持續(xù)上升，在0天、7天和14天3個時相點，hUCBDSCs組的

20、分泌量均高于hUCBDMSCs組。GM-CSF在hUCBDMSCs組表現(xiàn)為在第7天下降，在第14天上升；在hUCBDSCs組則表現(xiàn)為持續(xù)上升，且在后兩個時相點的含量高于hUCBDMSCs組。
　　 4.共培養(yǎng)后CD34+造血干細胞分別向粒系、紅系、巨核系和淋巴系定向分化的檢測
　　 經(jīng)免疫磁珠分選CD34+造血干細胞流式檢測陽性率為90.2％，共培養(yǎng)7天后兩組中CD34+造血干細胞下降；兩組中CD19、CD3和CD41a

21、呈陰性表達，CD33、CD71和CD14呈陽性表達。CD15在hUCBDSCs組呈陽性表達，在hUCBDMSCs組呈陰性表達。CD14的表達hUCBDSCs組高于hUCBDMSCs組；CD33和CD71在兩組的表達相當，無統(tǒng)計學意義，p>0.05。在共培養(yǎng)第14天，CD34+造血干細胞進一步下降；CD19和CD41a在兩組的表達仍為陰性，CD15、CD3、CD33、CD71和CD14表達陽性；兩組中CD33表達呈上升趨勢，CD71呈下降

22、趨勢；在hUCBDSCs組CD15的表達雖為上升趨勢，但此時分泌量低于hUCBDMSCs組；此時相點hUCBDSCs誘導CD34+造血干細胞向CD33+的髓系細胞和CD3+的淋巴細胞分化要強于hUCBDMSCs；在此時相點，紅系表達的CD71在兩組都呈明顯的下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.臍帶血經(jīng)相同密度梯度離心所得的單個核細胞，用合適的培養(yǎng)基培養(yǎng)可成功獲得hUCBDSCs和hUCBDMSCs，這兩類細胞具有不同的細胞生