1、侵襲性真菌病是導致免疫缺陷病人和危重病人死亡的主要原因之一。隨著腫瘤、血液病及獲得性免疫缺陷病人的逐年增多，侵襲性真菌病特別是白色念珠菌病日益受到醫(yī)學界的重視。其中，白色念珠菌感染可占臨床念珠菌感染的45％左右。本病危害性大、死亡率高，尚缺乏有效的診斷手段。常規(guī)血液培養(yǎng)陽性率低、耗時長；檢測真菌循環(huán)抗原(體)、特異性酶和代謝產(chǎn)物的血清學方法則存在特異性和敏感性低的缺陷。檢測方法的局限性導致真菌病的早期明確診斷十分困難，是影響患者預后的重

2、要因素之一。因而建立一種特異、靈敏、高效、快速的檢測系統(tǒng)是檢驗工作者急需解決的一個問題。 PCR法可以檢測出微量的真菌DNA，已成為真菌檢測的一個研究熱點。而RealTimePCR，即實時檢測PCR擴增產(chǎn)物并進行解析的方法，不僅秉承和發(fā)展了普通PCR的快速、高靈敏度檢出等全部優(yōu)點，同時克服了普通PCR不能準確定量、容易污染等的不足。由于其操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等特點，近年來開始受到真菌檢測研究者的關(guān)注。

3、 無論是普通PCR法還是RealTimePCR法檢測菌株的目的都是要為臨床服務，所以臨床標本的選擇很重要。選用血液標本早己達成共識，但具體而言，全血標本和血清標本哪一種更利于真菌的PCR早期檢測，仍然說法不一；并且如何更早地獲得足夠量的檢測模板也是一個急需解決的問題。鑒于此，本實驗試圖通過熒光定量PCR法研究白色念珠菌體外DNA釋放的動態(tài)過程，嘗試用RealTimePCR法檢測真菌，為指導臨床早期檢測侵襲性真菌病提供一定的依據(jù)。

4、 本研究以白色念珠菌rRNA基因復合體為靶標，采用prime5．O軟件包設計了一對白色念珠菌特異性引物，以白色念珠菌DNA為模板，并以其他菌種的念珠菌屬及臨床上常見的細菌DNA為陰性對照，進行PCR擴增，結(jié)果顯示該引物的特異性良好。將獲得的擴增產(chǎn)物進行測序和比對分析發(fā)現(xiàn)該測序結(jié)果與目的基因序列相同，進一步證實了PCR擴增的準確性和可靠性。 通過系列稀釋提取的白色念珠菌的核酸，發(fā)現(xiàn)使用常規(guī)PCR儀(Biometra公司)檢

5、測白色念珠菌DNA的靈敏度是100fg或者10一20個菌；而使用熒光定量PCR儀HghtCycler1．0系統(tǒng)(羅氏公司)檢測白色念珠菌DNA的靈敏度是10fg。 在上述實驗的基礎上，觀察白色念珠菌DNA釋放到胞外的動態(tài)過程。通過8個不同時間點提取上清中DNA量的變化情況，觀察了白色念珠菌在4種不同培養(yǎng)基中隨時間變化釋放到胞外的動態(tài)過程，以及加入單核吞噬細胞后對白色念珠菌DNA釋放的影響程度。 為進一步驗證血清和全血沉淀

6、物中DNA的主要存在方式，我們設計以下實驗，即在人全血中加入白色念珠菌孢子(代表真菌細胞內(nèi)的DNA)和光滑念珠菌基因組DNA(代表游離DNA)。經(jīng)離心后得到上清和沉淀物，分別提取DNA后，以白色念珠菌和光滑念珠菌特異的引物進行熒光定量PCR擴增。結(jié)果顯示游離DNA主要存在于血漿中，而真菌細胞內(nèi)的DNA主要存在于全血沉淀物中。 綜上所述，本研究采用熒光定量PCR的方法，觀察了白色念珠菌DNA釋放到胞外的動態(tài)過程，發(fā)現(xiàn)單核吞噬細胞在