1、幽門(mén)螺桿菌(Helicobactet pylori，Hp)是目前發(fā)現(xiàn)唯一能夠在人胃內(nèi)定植、生存的微需氧革蘭氏陰性桿菌。Hp是世界性分布的病原菌，它的感染是目前人類發(fā)生率最高的慢性細(xì)菌感染之一?，F(xiàn)已確認(rèn)，Hp感染是消化性潰瘍和慢性胃炎的重要病因，并與胃癌和胃淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)，流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)Hp感染還與冠心病、糖尿病、支氣管炎等關(guān)系密切。因此，研制有效的預(yù)防和治療疫苗來(lái)預(yù)防控制Hp感染，不失為一種簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)、高效的途徑。 黏附

2、素(HpaA)是暴露于Hp細(xì)菌表面的鞭毛鞘膜蛋白，也是該細(xì)菌主要的粘附因子之一，其核苷酸和氨基酸序列高度保守，能使Hp緊密粘附于胃上皮細(xì)胞。Hp感染病人血清中出現(xiàn)的HpaA抗體能與HpaA蛋白發(fā)生免疫反應(yīng)。Hp基因組中含有34個(gè)功能未明的外膜蛋白基因，一些實(shí)驗(yàn)研究表明，部分外膜蛋白分子具有良好的免疫活性，其中Hp外膜蛋白Omp22，已有研究表明其能夠分泌表達(dá)于細(xì)菌表面，并能引起Th1細(xì)胞較高的免疫反應(yīng)，有可能成為幽門(mén)螺桿菌疫苗研究的良好

3、免疫候選抗原。Hp疫苗研究已取得了一定成績(jī)，但一直令學(xué)者們遺憾的是單一抗原成分免疫動(dòng)物時(shí)，獲得的保護(hù)率均不理想，為了克服單種抗原免疫性較弱的不足，有學(xué)者建議將多種抗原成分聯(lián)合起來(lái)制作疫苗，增強(qiáng)免疫效果、提高免疫保護(hù)率。 本課題研究旨在對(duì)臨床分離株Hp MEL-HP27的omp22基因和hpaA基因進(jìn)行克隆，并通過(guò)氨基酸接頭構(gòu)建omp22-hpaA融合基因，生物信息學(xué)軟件分析兩個(gè)基因融合前后所表達(dá)蛋白的生物學(xué)特性；分別構(gòu)建表達(dá)om

4、p22、hpaA及其融合基因的原核表達(dá)系統(tǒng)，對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化和免疫原性鑒定；通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)所表達(dá)蛋白作為Hp疫苗抗原的免疫保護(hù)效果，為篩選高效的Hp疫苗研究奠定基礎(chǔ)。 實(shí)驗(yàn)方法 1．幽門(mén)螺桿菌omp22、hpaA基因克隆和生物信息學(xué)分析及其融合基因的構(gòu)建采用PCR方法，以本研究室從鄭州胃炎患者胃部分離的Hp菌株MEL-HP27的染色體DNA為模板，擴(kuò)增出omp22、hpaA基因片段，分別將他們插入克隆載體pBlueS

5、cript Ⅱ SK(-)，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)酶切和特異PCR 方法鑒定出陽(yáng)性重組載體，對(duì)插入目的片段進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用分子生物學(xué)軟件Omiga2.0和DNAstar對(duì)Hp MEL-HP27的Omp22、HpaA蛋白的生物化學(xué)特性進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)他們的柔韌性和細(xì)胞表位區(qū)域，并預(yù)測(cè)Omp22、HpaA和Omp22-HpaA的二級(jí)結(jié)構(gòu)、疏水性、抗原性等，比較兩基因融合前后的變化，選擇合適的氨基酸接頭。去除omp22基因的終止密碼子和hpa4基因的起

6、始密碼子，以重疊延伸PCR方法擴(kuò)增出帶柔韌接頭編碼序列的融合基因omp22-hpaA，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定。 2．幽門(mén)螺桿菌omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建及工程菌蛋白表達(dá)條件的初步優(yōu)化分別將omp22、hpaA和omp22-haaA從克隆載體中雙酶切后，回收目的DNA片段插入原核型表達(dá)載體pMAL-c2X，構(gòu)建目的蛋白基因與大腸桿菌麥芽糖結(jié)合蛋白基因融合表達(dá)的重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TB1感

7、受態(tài)細(xì)胞，氨芐青霉素抗性、藍(lán)-白斑試驗(yàn)篩選陽(yáng)性克隆，限制性內(nèi)切酶酶切及特異PCR鑒定出陽(yáng)性重組質(zhì)粒。采取不同的誘導(dǎo)時(shí)機(jī)、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時(shí)間等條件誘導(dǎo)重組菌表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物處理后經(jīng)SDS-PAGE電泳，分析目的蛋白在不同條件下的表達(dá)水平，選擇目的蛋白適宜的表達(dá)條件。 3．Omp22、HpaA和Omp22-HpaA融合蛋白的純化及其免疫學(xué)活性研究選取適宜條件對(duì)重組菌進(jìn)行大量誘導(dǎo)，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲粉碎，超聲上清經(jīng)初步鹽析后，應(yīng)用直鏈

8、淀粉親和層析柱進(jìn)行純化，Western blot鑒定目的蛋白純化前后的免疫反應(yīng)性。凝膠掃描法分析蛋白質(zhì)純度(SynGene，USA)，Bradford法測(cè)定蛋白質(zhì)含量。用純化的Omp22、HpaA、Omp22-HpaA和Hp菌體抗原免疫小白鼠獲得免疫血清，用制備免疫血清與重組蛋白進(jìn)行Western blot反應(yīng)，檢測(cè)重組蛋白的免疫學(xué)活性。 4．幽門(mén)螺桿菌外膜蛋白Omp22、黏附素HpaA和Omp22-HpaA融合蛋白免疫保護(hù)作用

9、的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究以純化的Omp22、HpaA、Omp22-HpaA、UreB為抗原，大腸桿菌不耐熱腸毒素?zé)o毒突變體mIX63為黏膜佐劑，經(jīng)口免疫昆明小鼠，每周1次，共免疫4次，并設(shè)立免疫佐劑和PBS對(duì)照組。末次免疫1周后，各組小鼠均用新鮮培養(yǎng)的Hp(NCTC11637)進(jìn)行攻擊感染，共攻擊感染2次，間隔10h。末次攻擊2周后處死小鼠，取小鼠胃組織分別作尿素酶定性試驗(yàn)和半定量試驗(yàn)、Hp培養(yǎng)、涂片Gram’s染色鏡檢和組織學(xué)檢查，檢測(cè)免疫接種

10、對(duì)Hp在小鼠胃內(nèi)定植的影響，評(píng)價(jià)重組抗原與佐劑組合的免疫保護(hù)效果。 5．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SAS 9.13統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料的比較采用單因素方差分析，均數(shù)間兩兩比較采用最小顯著差異法(Least significant deviation，LSD)，計(jì)數(shù)資料分析采用X<'2>檢驗(yàn)或Fisher's確切概率法，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)以P<0.05為差異有顯著性。 結(jié)論 1．從Hp鄭州分離株MEL-HP27基因組

11、DNA中成功克隆到外膜蛋白o(hù)mp22基因，該基因已被GenBank收錄，基因編號(hào)為DQ499023，是中國(guó)向GenBank提交的第一個(gè)omp22基因序列，也是GenBank第四個(gè)收錄的Hp omp22基因；同時(shí)還克隆到MEL-HP27黏附素hpaA基因，該基因已被GenBank收錄，基因編號(hào)為DQ353891。 2．采用重疊延伸PCR方法，通過(guò)柔韌氨基酸接頭連接成功構(gòu)建了omp22-hpaA融合基因，有效地保持Omp22、Hpa

12、A單體蛋白原有的抗原活性中心和生物學(xué)活性。 3．利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了omp22、hpaA和omp22-hpaA融合基因的原核表達(dá)系統(tǒng)pMAL-c2X-omp22-TB1、pMAL-c2X-hpaA-TB1、pMAL-c2X-omp22-hpaA-TB1，能夠穩(wěn)定高效表達(dá)重組蛋白rOmp22、rHpaA和rOmp22-HpaA。 4．純化的重組蛋白rOmp22，研究發(fā)現(xiàn)具有良好的免疫原性和免疫反應(yīng)性，為研究幽門(mén)螺桿菌疫苗