1、幽門螺桿菌是微需氧的革蘭陰性桿菌，呈螺旋狀。多數(shù)國家和地區(qū)Hp感染率高達50％以上，許多感染者都是無癥狀的，但是有部分感染者可出現(xiàn)急慢性胃炎和消化性潰瘍，Hp的持續(xù)性感染還與胃腺癌和胃淋巴瘤的發(fā)生密切相關。目前關于Hp疫苗的研究較少。 Hp粘附素是細菌鞭毛鞘膜蛋白，也是細菌主要的粘附因子之一。hpaA基因位于細菌基因組DNA上，其核苷酸或氨基酸序列高度保守，并且有研究發(fā)現(xiàn)在大約86％的Hp患者血清中可檢測到HpaA抗體，因此可作

2、為Hp基因工程疫苗的侯選抗原。 基因工程疫苗多以單一蛋白作為抗原，其免疫效果常不盡人意，通常需要使用佐劑來提高此類疫苗的免疫效果，有文獻報道LTB粘膜免疫佐劑活性明顯高于CTB，因此LTB作為疫苗佐劑更為合適。 材料方法： 1.菌株來源及培養(yǎng) 將本室保存的HpY06、SS1(sydneystrain1)菌株涂布于Hp選擇性平板培養(yǎng)基上，微需氧環(huán)境37℃培養(yǎng)5d，凡能在Hp選擇性培養(yǎng)基上生長、針尖樣透明菌落

3、、革蘭陰性細小彎曲桿菌、快速尿素酶試驗陽性、氧化酶試驗陽性、能與Hp全菌抗體發(fā)生凝集者鑒定為Hp。 大腸桿菌44815株購自中國藥品生物制品檢定所。將大腸桿菌44815株接種于LB瓊脂平板上，37℃培養(yǎng)24h。挑取單個菌落進行革蘭染色鏡檢，若是革蘭陰性、中等大小桿菌者，再次轉種培養(yǎng)。 2.細菌基因組DNA的制備 采用常規(guī)的苯酚—氯仿法提取HpY06株和大腸桿菌44815株培養(yǎng)物的基因組DNA，經無DNA酶的RNA

4、酶消化后，再用苯酚—氯仿法將提取的DNA溶于TE緩沖液中作為PCR的模板，用分光光度法測定DNA的濃度和純度。 3.hpaA基因和ltB基因的擴增 根據報道的hpaA和ltB的基因序列設計引物，采用PCR擴增hpaA和ltB全基因序列，溴乙錠染色的1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。 4.hpaA和ltB基因T-A克隆和核苷酸序列測定 采用上海申能博彩生物科技有限公司(SNBC)的3SPCRProduct

5、PurificationKitV2.0回收目的擴增片段。目的擴增片段連接于pUCm-T載體中，形成用于測序的pUCm-T-hpaA、pUCm-T-ltB重組質粒。轉化至E.coliDH5α中，經藍白篩選的陽性克隆擴增后用堿變性法提取重組質粒，雙酶切鑒定后用雙脫氧鏈末端終止法測定插入片段的核苷酸序列。所獲得的序列與GeneBank登錄的hpaA基因和ltB基因序列進行核苷酸同源性比較。 5.ltB-hpaA融合基因的構建

6、擴增含pUCm-T-ltB和pUCm-T-hpaA的E.coliDH5α，堿變性法提取質粒，經無DNA酶的RNA酶消化后，再用苯酚-氯仿法提取質粒。以pUCm-T-ltB質粒為模板，PCR擴增ltB全基因片段，ltB上游引物序列：5'-CCGGGATCCTGAATAAAGTAAATGTTA-3’(BamHⅠ)下游連接引物序列：5，-CTTTAAAATGATTATTTGCTCTGTTTTCCATACTGATTGCCGC-3’，反應條件同上

7、，采用凝膠回收試劑盒(BBST)回收目的片段。pUCm-T-hpaA質粒用BamHⅠ和EcoRⅠ37℃雙酶切2h，回收目的片段，紫外分光光度法測定其濃度。以總含量100ng、ltB∶hpaA≈2∶1兩種DNA回收片段為模板，反應總體積為90μl，內含除引物外的PCR各試劑，反應參數(shù)：94℃5min，×1；94℃30sec，45℃30sec，72℃150sec，×10；72℃10min，×1，以便形成復合模板。然后加入濃度均為250nmo

8、l/L的上述ltB上游引物和hpaA下游引物5'-CCGAAGCTTTCGGTTTCTCTTGTTTTTC-3’(HindⅢ)，反應參數(shù)：94℃3min，×1；94℃30S，50℃30S，72℃90S，×10；94℃30S，50℃30S，72℃180S(以后每循環(huán)增加15S)，×15；72℃10min，×1。1.5％的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物，目的擴增產物的預期大小為1177bp。 6.ltB-hpaA融合基因T-A克隆、亞克

9、隆和核苷酸序列測定 按上法將ltB-hpaA片段克隆、轉化、擴增、提取質粒。測序對比序列后，將重組質粒及pQE32雙酶切后獲得的目的片段進行連接，轉化于E.coliM15，獲得工程菌pQE32-ltB-hpaA-M15。然后擴增、提取質粒后再次測序。 7.目的重組蛋白表達和純化 重組表達系統(tǒng)pQE32-ltB-hpaA-M15分別在含1.0、0.5和0.1mmol/LIPTG的LB培養(yǎng)基中37℃震蕩培養(yǎng)，其中1.

10、0mmol/LIPTG誘導產物經超聲波破碎、5000r/min離心5min后分為上清和沉淀，采用SDS-PAGE檢查重組蛋白(rLTB-HpaA)的分子量、表達產量和存在形式。采用Ni-NTA親和層析法提純上述重組蛋白。 8.rLTB-hpaA免疫原性、免疫反應性和佐劑活性的鑒定 以兔抗Hp全菌抗體為一抗、HRP標記的羊抗兔IgG為二抗，用westernbolt檢測rLTB-HpaA的免疫反應性。NTA親和層析法(BBS

11、T)收集的rLTB-HpaA免疫家兔，用westernbolt檢測rLTB-HpaA的抗原性。 用牛GM1(Sigma)包被酶標板，洗滌后分別加入每孔4μg的rLTB-HpaA，重復4孔。以兔抗rLTB-HpaA血清為一抗、HRP標記羊抗兔IgG為二抗、OPT為底物，顯色后檢測OD490吸光值。實驗中以等量BSA代替rLTB-HpaA作為陰性對照。以陰性對照平均吸光值+3SD為陽性。 9.小鼠保護試驗 將BALB

12、/c小鼠分組，每組12只。各組分別命名為實驗組(rHpaA)、實驗組(rLTB-HpaA)、感染對照組和正常對照組。將rHpaA和rLTB-HpaA分別溶于pH7.4、0.01mol/LPBS中。各試驗組小鼠分別用rHpaA、rLTB-HpaA進行口服(灌喂)免疫，末次免疫后第28、30、32d三次灌喂5×1010CFU/ml的HpSS1株懸液200μl。末次感染4周后處死各組小鼠，取胃竇組織標本勻漿后接種于選擇性哥倫比亞血瓊脂平板，微

13、需氧條件下37℃培養(yǎng)5-7d，Hp鑒定方法同前。10.ELISA 用濃度為20μg/mlrLTB-HpaA融合蛋白包被酶標板，分別以1∶200稀釋的患者血清為一抗、HRP標記的羊抗人IgG為二抗、鄰苯二胺為底物，用ELISA來檢測126例Hp感染者血清中HpaA抗體存在情況。顯色后用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測490nm的吸光值，超過6份陰性血清平均吸光值+3SD者為陽性。 結果1.PCR ltB、hpaA、ltB-hpa

14、A的PCR擴增片段的大小分別約為375bp、802bp和1177bp。 2.核苷酸和氨基酸序列分析 與GenBank登錄的基因序列比較，所克隆的hpaA和ltB核苷酸序列相似性分別為94.25％～97.32％和99.12％～99.71％，氨基酸序列相似性為95.38％～98.46％和97.58％～99.19％。ltB-hpaA融合基因序列與ltB、hpaA基因序列完全相同。 3.表達載體的鑒定 pQE32

15、-ltB-hpaA經雙酶切和瓊脂糖凝膠電泳后，在預期位置上可見目的條帶；核苷酸序列測定結果證實了插入的目的基因序列和方向正確。 4.目的：蛋白的表達 SDS-PAGE結果表明，IPTG能較好地誘導目的蛋白rLTB-HpaA的表達，產量約占全菌蛋白的30％，但主要以包涵體形式存在。 5.rLTB-hpaA的免疫原性、免疫反應性和佐劑活性。 Westernbolt證實：兔抗Hp全菌抗體和NTA親和層析法收集的

16、rLTB-HpaA免疫家兔后產生的抗體均能與rLTB-HpaA結合。 anti-rLTB-HpaA血清1∶10、1∶20、1∶40、1∶80稀釋度時，rLTB-HpaA陽性判斷標準值分別為0.68、0.52、0.55和0.19，rLTB-HpaA試驗組OD490值分別為1.64、1.55、1.52、1.10，表明rLTB-HpaA能與牛GM1結合。 6.小鼠保護試驗 rHpaA免疫小鼠的保護率僅為66.7％，而r

17、LTB-HpaA免疫小鼠的保護率可增至83.3％。 7.ELISA結果 6例陰性血清的OD490均值±SD為0.11±0.03，陽性標準為0.20；81.6％患者血清(102/125)HpaA抗體檢測結果陽性，其OD490值范圍0.54～1.84。 6例細菌陰性對照的OD490均值±SD為0.04±0.04，陽性標準為0.16；41株Hp的HpaA檢測結果均陽性，其OD490值范圍0.52～1.47。 結