1、一、研究背景和目的 隨著“人類基因組計劃”的完成，揭開了人類遺傳信息的秘密。許多遺傳疾病和癌癥都與基因序列中的突變密切相關，在這些突變中單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymerphisms，SNP)是最豐富的遺傳變異，大約每100-300個堿基就有一個堿基可能發(fā)生突變，因此實現(xiàn)單堿基突變的早期、準確、簡便、快速的診斷，對于人類相關疾病的發(fā)病機理研究及早期治療具有非常重要的意義。目前，對單堿基突變的檢測方法

2、報道很多。傳統(tǒng)的方法普遍存在操作繁瑣費時費力，影響因素較多，不能通用。盡管目前有了基因芯片、SNP檢測儀等新的儀器設備和技術，但價格昂貴，僅適用大型科研機構。開發(fā)一些簡便、價廉、準確且易于臨床推廣的方法是一件很有價值的工作。 壓電DNA生物傳感器具有操作簡便，響應迅速，靈敏度較高，價格低廉等特點，已經(jīng)成為進行核酸的結構分析和單堿基突變檢測的重要手段。漏聲表面波(LeakySurface Acoustic Wave，LSAW)傳感

3、器，是新發(fā)展起來的生物診斷技術，綜合了物理、材料、微電子、信號處理、工藝等眾多學科技術，利用壓電晶體的特殊切向激勵出LSAW，當LSAW傳播路徑表面的質量負載發(fā)生微小改變時，LSAW傳播的頻率和相位發(fā)生相應的改變，從而對與傳感器表面生物敏感膜發(fā)生的生物學反應進行分析。與傳統(tǒng)的體波傳感器比較，LSAW傳感器具有高靈敏度、高精度、重復性及可靠性更好、功耗低、結構工藝好等優(yōu)點，這使LSAW傳感器具有非常廣泛的應用前景。 在本室前期工作

4、基礎上，本研究使用諧振型LSAW傳感器，結合DNA連接酶反應和酶生物信號放大系統(tǒng)建立了一種新的LSAW-SNP基因傳感器檢測方法，以乙型腦炎病毒E基因的一個SNP位點為靶點，初步研究LSAW-SNP基因傳感器檢測方法在實際樣本檢測中的應用情況。 二、方法 1.在前期研究的基礎上，對雙端諧振型傳感器的結構、相位記錄分析軟件、溫控系統(tǒng)進行改進，構建了更適合于液相檢測的LSAW傳感器系統(tǒng)。用NI虛擬儀器信號數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)，實現(xiàn)了

5、軟、硬件系統(tǒng)的改進。設計了射頻標簽式傳感器。 2.探討并優(yōu)化了DNA-LSAW基因傳感器檢測系統(tǒng)進行液相檢測時的各種影響因素，確定了雜交反應的時間。 3.探討酶生物信號放大系統(tǒng)用來放大LSAW基因傳感器檢測信號的可行性：分別用標記生物素和未標記生物素的探針固定于LSAW金膜的表面，然后加入標記了HRP的鏈酶親和素進行反應，最后加入DAB/H2O2，檢測相位的變化。 4.利用酶生物信號放大系統(tǒng)，結合Taq DNA連

6、接酶反應，建立LSAW-SNP基因傳感器檢測體系：分別合成兩條寡核苷酸靶序列，兩者之間僅存在一個堿基差異(A/G)。5'端巰基化修飾的DNA探針Probe-1通過自組裝固定在金電極的表面，等位基因的可變堿基位于該探針3'末端，與target-G的可變形式對應。加入靶序列和與靶序列中SNP位點下游片段完全互補的生物素標記探針Probe-2，雜交后經(jīng)熱穩(wěn)定Taq DNA連接酶連接DNA切口，然后經(jīng)堿變性解雜交與靶序列完全互補的探針保留在傳感

7、器表面，再加入鏈霉親和素連接的辣根過氧化物酶進行反應，最后加入DAB和H2O2，在金膜表面形成不溶性沉淀，導致LSAW基因傳感器相位增大，從而檢測到堿基變異位點的信息。 5.LSAW-SNP基因傳感器檢測方法對實際樣本的檢測： 以乙型腦炎病毒E基因的一個SNP位點(A2293G)為靶點，提取P3強毒株和SA14-14-2弱毒株的RNA，進行RT-PCR擴增，純化ssDNA擴增產(chǎn)物，進行測序。用建立的LSAW-SNP基因傳

8、感器檢測方法對Inmol/L ssDNA擴增產(chǎn)物進行檢測。 三、結果 1.改進后的雙端對諧振型LSAW傳感器穩(wěn)定性好，經(jīng)網(wǎng)絡分析儀和NI信號采集系統(tǒng)檢測10分鐘內(nèi)氣相和液相均≤0.1°，達到實驗檢測的要求。對同一濃度的探針和靶序列雜交，分別在網(wǎng)絡分析儀和NI信號采集系統(tǒng)上進行實驗，相位變化均為1.3°，達到了實驗的要求。 2.雙端對諧振型LSAW傳感器液相雜交反應的最適條件，最佳pH值為7.6，最佳離子濃度度為0

9、.3mol/L，最佳DNA探針固定濃度為0.5μmol/L，最佳靶序列濃度為1.0μmol/L。并確定雜交反應最終時間為33min。 3.經(jīng)酶生物信號放大后，標記生物素的探針相位變化顯著增大，相位增大了約16倍，而未標記生物素的探針相位變化很小。 4.LSAW-SNP基因傳感器檢測結果，target-G能引起相位的顯著變化，21倍于target-A。信號放大后的檢測時間可縮至20min。對不同濃度的target-G進行檢

10、測，最低檢出限為1×10-12mol/L。在1×10-12~1×10-6mol/L范圍內(nèi)target-G濃度的對數(shù)與傳感器的相位變化值成良好的線性關系，線性回歸方程為△P=1.8531gC+22.235，相關系數(shù)r=0.976。 5.SA14-14-2靶序列相位變化顯著，P3靶序列相位變化很小，與基因測序結果一致。 四、結論 1.反射柵陣列的引入提高了有用信號的檢測，改進后雙端對諧振型LSAW傳感器組成的檢測系統(tǒng)

11、可以滿足實驗檢測和研究。 2.酶生物信號放大系統(tǒng)可以顯著增加LSAW基因傳感器檢測DNA靶序列時的相位變化，有效提高了信噪比，顯著提高了檢測的靈敏度，為生物傳感器檢測生物學反應提供了可靠的信號放大方法，在生物傳感器領域有了極大的應用潛力。 3.基于DNA連接酶和酶生物放大反應的LSAW-SNP基因傳感器檢測系統(tǒng)通過對乙型腦炎病毒實際樣本SNP位點(A2293G)檢測，具有較高的特異性、靈敏度和準確性。為臨床SNP檢測提供