1、目的:
　　1、研究創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素膜成孔模序(rMpf)的成孔毒性和生物活性。
　　2、研究rMpf對Hela細(xì)胞的生物膜功能和結(jié)構(gòu)的影響。
　　3、進(jìn)一步完善創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素的結(jié)構(gòu)功能研究和對創(chuàng)傷弧菌致病機(jī)制的深入研究，為細(xì)菌膜成孔毒素對分子致病機(jī)理研究提供科學(xué)依據(jù)，也為進(jìn)一步研發(fā)阻斷抗細(xì)菌成孔毒素毒力的藥物奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1、rMpf融合蛋白的表達(dá)、純化和復(fù)性
　　IPTG誘導(dǎo)含pE

2、T-28a(+)-mpf質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)工程菌，表達(dá)rMpf融合蛋白并用SDS-PAGE分析;三步洗滌法與Ni2+-NTA親和層析法聯(lián)合應(yīng)用純化rMpf;利用稀釋復(fù)性與分步透析相結(jié)合的方案進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性。膜聯(lián)蛋白-FITC/PI染色通過流式細(xì)胞儀檢測復(fù)性后rMpf活性。
　　2、rMpf融合蛋白對Hela細(xì)胞生物膜功能和結(jié)構(gòu)的影響
　　rMpf融合蛋白作用于Hela細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合激光共聚焦顯微

3、鏡技術(shù)觀察DiI細(xì)胞膜熒光探針在rMpf作用后熒光分布的改變，MPTP檢測線粒體膜通道孔的形成與變化，JC-1檢測細(xì)胞線粒體膜電位變化，透射電鏡技術(shù)觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　結(jié)果:
　　1、rMpf融合蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性
　　含pET-28a(+)-mpf重組質(zhì)粒的E.coli BL21(DE3)通過0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后，產(chǎn)生27kDa特異性表達(dá)條帶，經(jīng)三步洗滌與Ni2+-NTA柱純化后的純度約

4、為95.0％。復(fù)性后rMpf作用Hela細(xì)胞，顯示其具有較好的生物學(xué)活性和細(xì)胞毒性。
　　2、rMpf融合蛋白對Hela細(xì)胞生物膜的功能和結(jié)構(gòu)的改變
　　rMpf可使Hela細(xì)胞的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，rMpf還可使Hela細(xì)胞的線粒體膜通道孔活性發(fā)生改變，造成MPTP開放，線粒體膜電位下降。rMpf作用Hela細(xì)胞后其細(xì)胞膜和線粒體等一系列細(xì)胞器發(fā)生明顯的形態(tài)學(xué)改變，提示細(xì)胞可能已經(jīng)發(fā)生凋亡或壞死。
　　結(jié)論: