1、目的:
　　 1、研究重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(recombinant Vibrio vulnificus hemolysin,rVvhA)對(duì)HUVEC和J774A.1細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用。
　　 2、研究膜膽固醇對(duì)重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素活性的影響。
　　 3、為探索天然創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(Vibrio vulnificus cytolysin,VVC)的細(xì)胞毒性分子機(jī)制提供一些實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　

2、 1、誘導(dǎo)含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌表達(dá)創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素融合蛋白rVvhA,應(yīng)用三步洗滌結(jié)合Ni2+親和層析方法對(duì)rVvhA進(jìn)行純化,利用稀釋復(fù)性加分步透析相結(jié)合的方法進(jìn)行蛋白質(zhì)復(fù)性。
　　 2、復(fù)性后rVvhA作用于HUVEC和J774A.1細(xì)胞,MTT測(cè)定細(xì)胞存活率。在rVvhA作用前,HUVEC和J774A.1細(xì)胞先經(jīng)MβCD預(yù)處理降低膜上膽固醇含量,待rVvhA作用HUVEC和J774A.

3、1細(xì)胞8h后,MTT測(cè)定細(xì)胞的存活率；Fluo-3 AM鈣離子熒光探針結(jié)合激光掃描共聚焦顯微鏡測(cè)定rVvhA作用細(xì)胞瞬間胞內(nèi)鈣離子濃度變化情況；測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)上清中的鉀離子和乳酸脫氫酶濃度；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡和壞死率。
　　 結(jié)果:
　　 1、含pET-28a(+)vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌經(jīng)0.5 mmol/L IPTG誘導(dǎo)后表達(dá)的融合蛋白Mr約為54 kDa,電泳結(jié)果與該融合蛋白的理論推算值基本相符。表達(dá)的

4、蛋白質(zhì)經(jīng)三步洗滌與Ni2+-NTA柱純化后,其純度達(dá)90.0％左右。純化的rVvhA稀釋復(fù)性后證明具有溶血活性。
　　 2、rVvhA作用HUVEC和J774A.1細(xì)胞可抑制細(xì)胞增殖,降低細(xì)胞的存活率,且呈劑量依賴性。rVvhA作用后細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加,培養(yǎng)上清中鉀離子濃度和乳酸脫氫酶活性也增加。流式測(cè)定結(jié)果可見1.0 HU/ml和2.0 HU/ml rVvhm可分別誘導(dǎo)J774A.1和HUVEC細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡,凋亡率分別為

5、(13.5±2.14)％和(14.8±2.3)％。2.0 HU/ml和3.0 HU/ml rVvhA可分別誘導(dǎo)J774A.1和HUVEC細(xì)胞發(fā)生明顯壞死。MβCD預(yù)處理可以減少細(xì)胞膜上膽固醇含量,且5mM MβCD作用HUVEC和J774A.1細(xì)胞30min沒有細(xì)胞毒性。比較MβCD預(yù)處理組與rVvhA直接作用組,可見前者細(xì)胞存活率明顯增加,rVvhA引起的鈣離子內(nèi)流、鉀離子和乳酸脫氫酶釋放均受到不同程度的抑制,rVvhA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡