1、論文題目：重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(rVvhA)對(duì)人單核白血病細(xì)胞(THP1)損傷機(jī)制的研究答辯委員會(huì)主席：答辯委員會(huì)成員：呂斌‘論文答辯日期：二0一三年五月一一啤一吼一托一二溫州醫(yī)學(xué)院碩士學(xué)位論文重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素(rVvhA)對(duì)人單核白血病細(xì)胞(THP1)損傷機(jī)制的研究中文摘要目的：1、研究rVvhA對(duì)THP1細(xì)胞的生長抑制作用。2、研究rVvhA對(duì)THP1細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度的影響。3、研究rVvhA致THP1細(xì)胞的凋亡途徑。方法：1、

2、IPTG誘導(dǎo)含pET28a()vvhA重組質(zhì)粒的BL21大腸桿菌，表達(dá)獲取重組創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞毒素(rVvhA)，SDSPAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。三步洗滌、變性、Ni2NTA親和層析法純化表達(dá)產(chǎn)物。復(fù)性結(jié)合分步透析法復(fù)性目的蛋白。活性目的蛋白經(jīng)冷凍干燥、PBS溶解、濃度測(cè)定分裝儲(chǔ)存于80。C。2、CCK一8法分析不同濃度rVvhA活性蛋白對(duì)THP1細(xì)胞生長抑制作用。同時(shí)，光學(xué)顯微鏡記錄細(xì)胞的形態(tài)變化。3、可見分光光度法測(cè)定rVvhA作用THP

3、1細(xì)胞培養(yǎng)上清中鉀離子。4、比色法測(cè)定rVvhA作用THP1細(xì)胞培養(yǎng)上清中乳酸脫氫酶。5、激光共聚焦顯微鏡測(cè)定rVvhA作用THP一1細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的瞬間變化。CCK8法分析鈣離子對(duì)THP1存活率的影響。6、酶標(biāo)儀測(cè)定rVvhA作用THP1細(xì)胞內(nèi)caspase3和caspase9的活性。7、AnnexinVFITC／PI標(biāo)記法檢測(cè)rVvhA作用THP1細(xì)胞的凋亡及壞死率。結(jié)果：1、重組蛋白分子量大小約為54kDa。經(jīng)三步洗滌及Ni2N

4、TA層析純化后，其純度可達(dá)90O％左右。純化目的蛋白經(jīng)復(fù)性透析后具有溶血活性。2、rVvhA活性蛋白對(duì)THP1細(xì)胞有細(xì)胞毒性作用，且呈劑量依賴性。6、8、10、12、14、16、1899／mlrVvhA作用5h后，THP1存活率分別為885％、795％、715％、6875％、5512％、4523％、3825％。普通顯微鏡觀察到，隨著蛋白作用濃度的提高，細(xì)胞開始發(fā)生皺縮，變形，而1899／mlrVvhA作用5h后細(xì)胞出現(xiàn)裂解死亡。3、12