1、背景和目的： 原癌基因和抑癌基因是在細(xì)胞，生長過程中扮演者重要角色的兩大類基因。而原癌基因HER2的擴(kuò)增是與乳腺癌相關(guān)的基因表達(dá)中最常見的改變。HER2基因位于17號染色體，編碼一種跨膜的具有酪氨酸激酶活性的生長因子受體。在乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中HER2基因擴(kuò)增或蛋白過表達(dá)的發(fā)生率約為20％～30％。有研究表明HER2基因擴(kuò)增或蛋白過表達(dá)不僅是重要的與乳腺癌不良預(yù)后相關(guān)生物學(xué)標(biāo)記，而且是對乳腺癌化療及內(nèi)分泌治療反應(yīng)具有指導(dǎo)作用的生物

2、學(xué)標(biāo)記，雖然關(guān)于HER2能否作為確實(shí)可行的預(yù)后指標(biāo)尚有不同的觀點(diǎn)，然而對HER2表達(dá)狀態(tài)的檢測已成為最佳化乳腺癌治療方案的重要步驟。免疫組化(IHC)和熒光原位雜交(FISH)已成為檢測HER2表達(dá)狀態(tài)的兩種最常用的方法。而且均被國內(nèi)和國際的治療指南所推崇但究竟誰是檢測HER2表達(dá)狀態(tài)最佳的方法？是IHC的蛋白檢測法？還是FISH的基因檢測法？ 因此，本課題的目的之一是在當(dāng)?shù)氐娜巳褐星罢靶缘难芯咳橄侔┗颊哧P(guān)于HER2狀態(tài)檢測的F

3、ISH和IHC兩種方法的相關(guān)性以及乳腺癌HER2基因表達(dá)與乳腺癌臨床預(yù)后因素、激素受體表達(dá)的關(guān)系。為關(guān)于HER2基因在乳癌患者中表達(dá)比例的流行病學(xué)資料提供一些數(shù)據(jù)，為臨床推廣建立FISH檢測奠定一定的基礎(chǔ)。 在浸潤性乳腺癌病例中常常伴隨著17號染色體拷貝數(shù)的異常改變，其拷貝數(shù)可通過常規(guī)的遺傳學(xué)方法和FISH檢測來判斷。而這種改變常常影響到HER2基因的擴(kuò)增和蛋白的表達(dá)。Watters和他的同事發(fā)現(xiàn)17號染色體拷貝數(shù)的異常改變與組

4、織分級III和ER陰性的的病例相關(guān)，但對生存期無明顯影響；另有研究提示17號染色體拷貝數(shù)的異常改變與乳腺癌不良預(yù)后因素相關(guān)。 因此，本課題的目的之二是當(dāng)?shù)氐娜巳褐醒芯咳橄侔┗颊?7號染色體非整體性的發(fā)生率；分析17號染色體倍體性與HER2基因表達(dá)及HER2蛋白表達(dá)的相關(guān)性。以及17號染色體拷貝數(shù)與乳腺癌臨床預(yù)后因素、激素受體表達(dá)的關(guān)系。為探討17號染色體倍體性這一遺傳特征與乳腺癌生物學(xué)行為及預(yù)后的關(guān)系提供依據(jù)，進(jìn)而為綜合評估乳腺

5、癌預(yù)后提供參考指標(biāo)。 MicroRNA簡稱miRNAs是生物體內(nèi)固有的單鏈、非蛋白編碼的長約22 nt的小分子RNA，它們主要通過與靶mRNA的結(jié)合以轉(zhuǎn)錄后的方式調(diào)控著基因表達(dá)，成熟miRNAs通過其5’第2-8個核苷酸(種子序列)與它們的靶mRNAs的3’-UTR內(nèi)的互補(bǔ)位點(diǎn)結(jié)合而識別其靶mRNAs，通過使其靶mRNAs的翻譯抑制或降解來抑制基因表達(dá)，它們己成為基因表達(dá)的重要調(diào)節(jié)因子。功能學(xué)研究表明miRNAs參與調(diào)控著細(xì)胞

6、的增殖、分化和死亡。有研究提示，在腫瘤細(xì)胞中miRNAs存在著異常的表達(dá)或突變，這表明miRNAs可能成為一類新的原癌基因或抑癌基因。鑒于miRNAs在腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展的作用，通過干預(yù)腫瘤細(xì)胞內(nèi)miRNAs的水平來進(jìn)行腫瘤的治療的策略逐漸形成。就與HER2基因相關(guān)的miRNAs而言，有研究提示在小葉癌和導(dǎo)管癌HER2陽性和HER2陰性標(biāo)本的對比中并未發(fā)現(xiàn)有miRNAs的異常改變，另一近期的研究表明在193例原發(fā)的乳腺癌組織中miRNAs

7、表達(dá)譜的測定中未發(fā)現(xiàn)特異性的miRNAs與腫瘤分期、血管浸潤、Her2表達(dá)相關(guān)。因此作用于HER2基因的天然miRNAs目前并未有確切的研究結(jié)果。在本文中，我們應(yīng)用生物信息學(xué)的方法選定兩個不同保守性的與HER23’-UTR有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs: miR-548d-3p、miR-559，隨之應(yīng)用ThepMIR_REPORTTM miRNAs表達(dá)報(bào)告載體進(jìn)行驗(yàn)證，即當(dāng)特定的miRNAs與重組載體上的目標(biāo)mRNA結(jié)合時，能阻斷其蛋白的

8、表達(dá)，進(jìn)而降低其熒光素酶的活性。 因此本課題的目的之三是初步研究miR-559和miR-548d-3p在參與調(diào)控HER2基因表達(dá)方面的作用，為HER2基因分子靶向治療提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。 研究方法： 1.應(yīng)用免疫組織化學(xué)法(IHC)分別檢測52例人乳腺癌組織中HER2蛋白、ER蛋白、PR蛋白的表達(dá)。應(yīng)用熒光原位雜交(FISH)的方法檢測52例人乳腺癌組織中HER2基因的表達(dá)，以及17號染色體的表達(dá)。 2.

9、收集乳腺癌病例的臨床資料：絕經(jīng)年齡、腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、術(shù)后分期等。 3.應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析HER2基因與HER2蛋白、預(yù)后因素、激素受體表達(dá)的關(guān)系；分析17號染色體倍體性與HER2基因、HER2蛋白，預(yù)后因素、激素受體表達(dá)的關(guān)系。 4.用生物信息學(xué)的方法預(yù)測與HER23’-UTR有互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)的miRNAs并計(jì)算其自由能(△G):本課題中通過生物信息學(xué)的方法，選取miR-559和m1R-548d-3p作為我們的目的m

10、iRNAs。采用mFold Software分析HER23’-UTR與miR-559、miR-548-3p互補(bǔ)結(jié)合位點(diǎn)5’端與3’端各70個核苷酸序列的自由能，從而預(yù)測此位點(diǎn)的可接近性。 5.重組質(zhì)粒的構(gòu)建：將618bp的HER23’-UTR的基因序列；611bp的缺失了miR-559種子位點(diǎn)(TTACTTT)的HER23'-UTR基因序列；611bp的缺失了miR-548-3p種子位點(diǎn)(GTTTTTA)的HER23'-UTR基

11、因序列亞克隆到pMIR-Luc載體中熒光素酶基因開放閱讀框的下游，并通過測序來驗(yàn)證其方向性和正確性。 6.轉(zhuǎn)染和熒光素酶活性的檢測：上述不同的重組載體與β-gal對照載體，以及相應(yīng)濃度的不同的miRNAs前體一同轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞，不同的miRNAs前體包括陰性對照前體、m1R-559前體、miR-548d-3p或m1R-559加上-548d-3p前體；轉(zhuǎn)染后48小時檢測熒光素酶活性。 研究結(jié)論： 1.52例患者

12、中HER2基因過表達(dá)的比例為38％。 2.HER蛋白IHC檢測和HER2基因FISH法總體上具有明顯的相關(guān)性，但在IHC2+的情況存在結(jié)果不一致的現(xiàn)象，而對于IHC2+的患者應(yīng)進(jìn)一步作FISH檢測以明確診斷。 3.HER2擴(kuò)增與乳腺癌不良預(yù)后指標(biāo)有密切相關(guān)。 4.52例樣本中乳腺癌非整體性的比例約為44％。 5.17號染色體的表達(dá)水平分別與HER2基因及蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)。 6.17號染色體的表

13、達(dá)水平的增高與乳腺癌不良預(yù)后指標(biāo)有密切相關(guān)。 7.miR-548d-3p和miR-559兩個miRNAs均能分別與HER2基因的mRNA的3'-UTR起到特異性的識別和結(jié)合作用，進(jìn)而翻譯抑制重組載體熒光素酶蛋白的表達(dá)，降低熒光素酶的活性，且其效力與轉(zhuǎn)染的miRNAs前體的濃度呈正相關(guān)。而miR-548d-3p和miR-559兩個miRNAs聯(lián)合共轉(zhuǎn)染后明顯地表現(xiàn)出高于其中一個單獨(dú)轉(zhuǎn)染的協(xié)同地翻譯抑制作用。由此初步證實(shí)miR-54