1、腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MTA1最初是在1993年發(fā)現(xiàn)高表達(dá)于具有高轉(zhuǎn)移潛能的大鼠乳腺癌細(xì)胞系中，后來(lái)證實(shí)MTA1不僅參與了腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程，還參與了腫瘤其他多種惡性能力的調(diào)控，如細(xì)胞增殖、血管生成、耐放化療等等，最終導(dǎo)致腫瘤的高復(fù)發(fā)和不良預(yù)后。雖然已經(jīng)經(jīng)歷了20多年的研究歷史，但是我們對(duì)于MTA1(cancer metastasis-associated gene1)的作用機(jī)制依然所知甚少。目前為止，關(guān)于MTA1的作用機(jī)制唯一比較清楚的

2、就是核小體重塑和組蛋白脫乙?；疦uRD(Nucleosome Remodeling and histone Deacetylation)復(fù)合體。通過(guò)NuRD復(fù)合體，MTA1參與了多種腫瘤抑癌基因的轉(zhuǎn)錄抑制。然而，后來(lái)發(fā)現(xiàn)MTA1參與的許多過(guò)程都不依賴于NuRD復(fù)合體，并且NuRD無(wú)法解釋MTA1對(duì)Pax5、BCAS3、FosB等基因的轉(zhuǎn)錄激活作用，因此除了NuRD之外，我們推測(cè)還存在其他未知的作用機(jī)制。至于MTA1的亞細(xì)胞定位，現(xiàn)有文獻(xiàn)

3、提示MTA1主要定位于胞核，而對(duì)于MTA1更精細(xì)的亞細(xì)胞定位目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，而對(duì)于MTA1是否存在胞漿定位尚存在爭(zhēng)議。
　　 一個(gè)蛋白在細(xì)胞中的精確定位及相互作用信息對(duì)于揭示其功能及機(jī)制具有非常重要的作用。因此，為了更深入地揭示MTA1在腫瘤中的功能機(jī)制，我們首先利用免疫組化，細(xì)胞免疫熒光、GFP標(biāo)簽追蹤、Western Blot、IP及原位co-IP等多種技術(shù)對(duì)MTA1的核漿定位進(jìn)行了一個(gè)全面系統(tǒng)地研究。通過(guò)對(duì)內(nèi)源及外源M

4、TA1的精確定位檢測(cè)，我們發(fā)現(xiàn)MTA1在胞核及胞漿中均存在明顯分布。同時(shí)我們還意外地發(fā)現(xiàn)MTA1在某些細(xì)胞的核膜上也有明顯分布，而MTA1穩(wěn)轉(zhuǎn)高表達(dá)細(xì)胞系中獲得的MTA1定位追蹤圖片則直接顯示MTA1是一個(gè)核漿穿梭蛋白。MTA1在所有我們檢測(cè)過(guò)的樣品中均有表達(dá)，包括人及小鼠成體正常組織、小鼠胚胎組織、結(jié)腸癌組織、正常及腫瘤細(xì)胞系，表明MTA1在正常及腫瘤細(xì)胞均發(fā)揮重要作用。在正常成體組織，MTA1在腦、肝、腎及心肌等組織中表達(dá)量相對(duì)較高

5、，并且除心肌和骨骼肌之外，MTA1主要定位于胞核。在骨骼肌，MTA1與SMN共定位于肌小節(jié)中的Z線上。而在小鼠胚胎組織，MTA1在腦、眼、脊髓等神經(jīng)組織處具有明顯高表達(dá)，并且在大部分組織中都主要定位于胞漿。通過(guò)對(duì)高密度結(jié)腸癌芯片染色結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析，我們發(fā)現(xiàn)胞核及胞漿MTA1均參與了腫瘤的進(jìn)展過(guò)程，但在腫瘤細(xì)胞的分化調(diào)控中，核MTA1發(fā)揮著主要作用。
　　 MTA1在細(xì)胞核中發(fā)揮染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)控因子的作用。染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)在調(diào)控基

6、因表達(dá)及DNA相關(guān)生理過(guò)程中發(fā)揮著其重要的作用。在該部分研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因MTA1是一個(gè)染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)控因子，它可以導(dǎo)致間期染色質(zhì)及M期染色體發(fā)生顯著的去凝聚作用。我們發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期中，MTA1與DNA的相互作用呈現(xiàn)一個(gè)動(dòng)態(tài)的、周期性的分離與結(jié)合的過(guò)程，該周期性過(guò)程在有絲分裂前期及末期染色質(zhì)/染色體結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)換的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。雖然MTA1與染色質(zhì)重塑因子Mi-2具有相互作用并且共同位于NuRD復(fù)合體中，但是MTA1

7、的染色質(zhì)去凝集作用并不依賴于Mi-2。H1可以通過(guò)結(jié)合于DNA參與維持和穩(wěn)定染色質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明MTA1在胞內(nèi)可以顯著降低H1與DNA之間的相互作用，并且在M期MTA1與DNA的周期性結(jié)合與分離有助于調(diào)控H1與DNA之間的周期性結(jié)合能力，從而參與M期染色質(zhì)與染色體結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)換調(diào)控。雖然MTA1可以導(dǎo)致染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生廣泛的去凝集作用，但是MTA1的高表達(dá)只對(duì)一小部分基因產(chǎn)生了明顯的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用，包括轉(zhuǎn)錄激活和轉(zhuǎn)錄抑制雙重

8、調(diào)控作用。MTA1高表達(dá)后導(dǎo)致的差異表達(dá)基因在分布模式上具有明顯的染色體偏向性，并且上調(diào)基因和下調(diào)基因具有相似的分布趨勢(shì)。差異基因的精確定位結(jié)果顯示，上調(diào)基因和下調(diào)基因大部分以成簇方式分布于染色體的同一區(qū)域中，表明MTA1具有結(jié)構(gòu)依賴性的調(diào)控模式。因此，在本部分我們發(fā)現(xiàn)MTA1具有染色質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)調(diào)控因子的新功能，該功能在細(xì)胞周期中染色質(zhì)/染色體之間的的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變過(guò)程中及間期染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性中調(diào)控中均發(fā)揮重要作用。
　　 MTA1在

9、胞漿中通過(guò)結(jié)合于紡錘體微管發(fā)揮抑制紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)(SAC)激活的功能。在間期，MTA1少量定位于胞漿，通過(guò)與α-tubulin共定位，我們發(fā)現(xiàn)這部分MTA1主要沿著微管分布。在M期，MTA1具有周期依賴性的定位模式，其中大部分時(shí)間MTA1都主要定位于胞漿，結(jié)合于紡錘體微管并隨之運(yùn)動(dòng)。在MTA1與細(xì)胞周期調(diào)控功能的探索過(guò)程中，我們發(fā)現(xiàn)MTA1對(duì)nocodazol引起的紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)激活具有很明顯的抑制作用。MTA1在HCT116細(xì)胞中的高表達(dá)

10、會(huì)導(dǎo)致染色體排列及分離異常，從而顯著增加微核及多核細(xì)胞的比例，這些現(xiàn)象都是SAC功能異常的標(biāo)志性特征。TPR是一個(gè)核孔復(fù)合體蛋白，其在間期參與mRNA及蛋白的核外轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控，而在M期則發(fā)揮SAC的調(diào)控功能。通過(guò)IF及免疫熒光共定位技術(shù)，我們發(fā)現(xiàn)MTA1與TPR在間期核膜及M期紡錘體上均具有相互作用。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果表明MTA1通過(guò)結(jié)合并抑制TPR的SAC正向調(diào)控功能從而抑制SAC的激活，并且MTA1可以與MAD1-MAD2復(fù)合體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)

11、合TPR，MTA1高表達(dá)可以顯著降低MAD1-MAD2的相互作用，而該相互作用在SAC激活過(guò)程中發(fā)揮著關(guān)鍵的作用。
　　 另外，MTA1的亞細(xì)胞定位及相互作用蛋白質(zhì)組信息提示MTA1還具有RNA調(diào)控功能。有文獻(xiàn)報(bào)道MTA1在核仁中為陰性表達(dá)，然而通過(guò)對(duì)內(nèi)源及外源MTA1在核仁中的精確檢測(cè)，我們確認(rèn)MTA1在核仁中具有普遍但是相對(duì)較低的表達(dá)水平。高分辨率的免疫電鏡技術(shù)結(jié)果顯示MTA1在核仁中主要定位于致密纖維組分區(qū)(DFC)及顆粒

12、區(qū)(FC)。MTA1在核仁中的精確定位及相互作用蛋白信息均表明，MTA1在核仁中參與了rRNA的加工剪切及核糖體亞基的裝配過(guò)程。另外，我們首次發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)MTA1在胞漿中存在于大量RNP顆粒中。MTA1 RNP顆粒的相關(guān)特性分析結(jié)果表明，MTA1參與了RNA的運(yùn)輸、穩(wěn)定性、翻譯及應(yīng)激狀態(tài)下的儲(chǔ)存調(diào)控。通過(guò)GO分析，我們發(fā)現(xiàn)在228個(gè)MTA1候選相互作用蛋白中有74(32.5％)個(gè)為RNA結(jié)合蛋白，并且MTA1相互作用蛋白質(zhì)組高度富集于RN

13、A調(diào)控相關(guān)功能類別之下，如RNA加工、剪切、翻譯、穩(wěn)定性、核糖體發(fā)生等等。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明MTA1敲降后對(duì)966個(gè)可變剪切事件產(chǎn)生了顯著影響。并且有趣的是，外源MTA1的高表達(dá)對(duì)其自身mRNA的可變剪切也具有顯著影響。
　　 綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)MTA1是一個(gè)在核仁、胞核、核膜及胞漿中穿梭分布的蛋白;其在細(xì)胞周期中具有周期性的動(dòng)態(tài)定位模式;利用MTA1的候選相互作用蛋白我們構(gòu)建了MTA1在整個(gè)基因組中的相互作用網(wǎng)絡(luò)。通過(guò)以上定位