1、本研究的目的：探討ARHI基因作用于ras通路的具體部位，和對EGF自分泌的影響以及對ras相關的細胞內信號蛋白(EGFR、ERK1/2、pan-Ras)的作用初探。研究分兩個部分： 第一部分ARHI在胰腺癌中的抑癌作用以及對EGF-EGFR-Ras-Raf-MAPK/ERK的影響。 材料和方法：采用質粒擴增和鑒定的方法獲取并驗證了載有野生型ARHI基因的質粒pIRES2-EGFP-ARHI；選取ARHI基因缺失，ras

2、突變細胞株Panc-1為研究對象，分別將重組質粒plRES2-EGFP-ARHI瞬時轉染和未轉染細胞(陰性對照)進行了以下研究： 1、通過繪制生長曲線分析EGF刺激下ARHI基因對胰腺癌細胞增殖的影響； 2、ELISA檢測ARHI基因轉染對胰腺癌細胞株EGF自分泌環(huán)的影響：細胞培養(yǎng)上清中EGF含量和細胞膜及胞質中EGFR的表達情況； 3、Westemblot方法檢測ARHI蛋白的表達對Panc-1細胞內EGF-E

3、GFR-Ras-Raf-MAPK/ERK1/2通路蛋白pan-Ras，P-ERK的影響，其中蛋白變化以與參照蛋白灰度比值為單位。 結果： 1.細胞增殖速率：轉染pIRES2-EGFP-ARHI后的Panc-1細胞增殖受到抑制，與對照組相比有顯著性差異(p<0.05)； 2.EGF-ELISA和EGFR-ELISA。 1)ARHI轉染組和未轉染組在單一DMEM培養(yǎng)液中EGF分泌均低于EGF-ELISA試劑盒

4、敏感的下限，且二者間不存在顯著性差異(p>0.05)。 2)ARHI轉染組和未轉染組細胞膜和細胞質中EGFR含量不存在顯著性差異(p>0.05)。但是兩組細胞中EGFR的表達均受EGF濃度、作用時間的影響，其中高濃度組(100ng/mL)和空白組(0ng/mL)、低濃度組(10ng/mL)存在顯著性差異(p<0.05)：EGF低濃度下可以誘導EGFR表達增加，高濃度下反而抑制其表達。不同時間(24、48、72、96小時)組間EG

5、FR表達存在顯著性差異(p<0.05)。 3.Westem blot檢測pan-Ras和P-ERK/T-ERK。 1)ARHI轉染組和未轉染組細胞內EGF-EGFR-Ras-Raf-MAPK/ERK通路蛋白pan-Ras表達存在顯著性差異(p<0.05)。轉染組24小時以后轉染組中Ras蛋白明顯下降，與對照組相比有顯著性差異(p<0.05)。并且不同濃度下轉染組pan-Ras均隨時間而表達量減少。非轉染組在低濃度EGF刺

6、激pan.Ras短時間(48小時)內呈上升的趨勢，之后呈下降；而高濃度EGF刺激下，pan-Ras的表達開始比較平穩(wěn)，長時間(72小時)后才呈現上升的趨勢。 2)ARHI轉染組和未轉染組細胞內EGFR-Ras-Raf-MAPK/ERK通路蛋白P-ERK表達存在顯著性差異(p<0.05)。24小時內轉染組P-ERK表達有短暫的升高，與對照組相比有顯著性差異(p<0.05)。EGF=200ng/mL時，各個時間點轉染組和對照組ERK

7、活性均存在明顯差異(p<0.05)，說明在EGF高濃度下，ARHI對EGF-EGFR-Ras-Raf-MAPK/ERK通路影響最為顯著。轉染組和為轉染組的P-ERK表達均受到EGF濃度、作用時間及其交互作用的影響。因而得出：ARHI和EGF共同作用于EGF-EGFR-Ras-Raf-MAPK/ERK通路，P-ERK表達受兩者的共同影響。 第二部分.ARHI穩(wěn)定轉染Panc-1單克隆細胞株建立的探索。采用G418篩選方法設立篩選濃

8、度，20天挑取單克隆細胞團，在擴大培養(yǎng)的過程中，細胞逐漸死亡。 結論： 1.ARHI基因可以抑制腫瘤細胞的增殖，但不改變腫瘤細胞的形態(tài)。 2.ARHI基因不影響腫瘤細胞外分泌EGF(低于試劑盒敏感下限)。 3.ARHI基因不改變腫瘤細胞~EGFR的表達，外源性EGF卻能對EGFR的表達起作用。 4.ARHI基因能夠抑制pan-Ras蛋白的表達，外源性EGF也對pan-Ras蛋白的表達起作用。