1、研究背景:
　　 腎移植是終末期腎臟病主要替代療法之一。隨著更新更有效的免疫抑制劑的應(yīng)用和不斷完善，移植手術(shù)技巧的改進(jìn)，組織配型、器官保存技術(shù)的提高，移植后早期急性排斥反應(yīng)發(fā)生率較前明顯下降，而移植腎的長(zhǎng)期成活仍然是醫(yī)學(xué)上的難題。目前研究數(shù)據(jù)表明，盡管移植腎1年存活率普遍可以達(dá)到90％水平，通常每年仍然有4～5％移植腎逐漸喪失，導(dǎo)致移植腎的5年存活率大概為70％，10年存活率僅為50％左右，最終面臨二次手術(shù)或血液透析治療。近期研

2、究發(fā)現(xiàn)，影響長(zhǎng)期移植腎功能的主要因素是慢性移植腎失功。慢性移植腎失功臨床上主要表現(xiàn)無(wú)明顯誘因下出現(xiàn)蛋白尿和高血壓及伴有腎功能血肌酐爬行性上升，最終進(jìn)展為終末期腎臟病。腎小球硬化、血管病變、腎小管萎縮和腎間質(zhì)纖維化是慢性移植腎失功主要病變特征，而血管病變、腎小管萎縮、間質(zhì)纖維化均與組織中淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞和肥大細(xì)胞浸潤(rùn)相關(guān)。已有的研究結(jié)果證明慢性炎性反應(yīng)是各種腎臟疾病中腎單位損傷的關(guān)鍵病理過(guò)程，包括慢性移植腎失功。
　　 最近的研究

3、揭示GSK-3β介導(dǎo)的炎性反應(yīng)與移植腎功能的惡化相關(guān)，但其確切的機(jī)制仍未完全闡明。糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，GSK-3β調(diào)節(jié)多種細(xì)胞反應(yīng)，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、程序性死亡和炎性反應(yīng)。GSK-3β參與多個(gè)信號(hào)通路，如GSK-3β與wnt、磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)、NF-κB等信號(hào)通路存在相關(guān)性[1]。GSK-3β最初被認(rèn)為可作為糖代謝的調(diào)節(jié)酶

4、。后續(xù)的研究表明[2]，GSK-3β還涉及到其他細(xì)胞過(guò)程，如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、胰島素的作用、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、組織細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期進(jìn)程與生存。GSK-3β通過(guò)絲氨酸殘基磷酸化而失活，GSK-3β的底物需先預(yù)磷酸化，磷酸化后底物可提高GSK-3β與其酶促底物的磷酸化作用，從而增加GSK-3β的活性，即GSK-3β第9位的Ser(絲氨酸)位點(diǎn)磷酸化，可抑制GSK-3β的活性，進(jìn)而通過(guò)相應(yīng)的信號(hào)通路磷酸化下游底物而發(fā)揮其生物學(xué)功能。目前研究發(fā)現(xiàn)，GS

5、K-3β調(diào)控著促炎因子核因子κB(NF-κB)的活化，及NF-κB介導(dǎo)的趨化因子的表達(dá)。近年來(lái)一些研究揭示GSK-3β參與人和實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭械难装Y性疾病，如急性腎衰竭、糖尿病腎病、慢性移植腎腎病。GSK-3β有促炎性反應(yīng)的作用，GSK-3β是炎癥過(guò)程的一個(gè)主要因素，已在心理障礙、阿爾茨海默病、糖尿病、腫瘤中得到證實(shí)。GSK-3β促進(jìn)炎性因子的產(chǎn)生和細(xì)胞遷移，在許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)抑制GSK-3β的活性和炎性反應(yīng)，對(duì)機(jī)體起到保護(hù)作用。因此，

6、抑制GSK-3β的活性可作為治療腎臟疾病的靶點(diǎn)。本研究主要檢測(cè)移植腎腎組織中GSK-3β的表達(dá)，并分析GSK-3β的表達(dá)與移植組織腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化、小管萎縮的關(guān)系，探討GSK-3β在慢性移植腎失功中作用。
　　 研究目的:
　　 研究慢性移植腎失功移植腎組織病理學(xué)特點(diǎn)。探討糖原合成酶激酶-3beta(GlycogenSynthasekinase-3beta)在移植腎組織中表達(dá)及意義。探討GSK-3beta在

7、慢性移植腎失功患者移植腎纖維化中的作用及機(jī)制，進(jìn)一步闡明移植腎纖維化的分子病理機(jī)制，為臨床防治慢性移植腎失功提供相應(yīng)的理論和新的思路。
　　 研究方法:
　　 臨床資料:
　　 收集181醫(yī)院2007年1月至2009年12月因蛋白尿或肌酐升高而行腎臟穿刺術(shù)的腎移植患者的腎穿標(biāo)本。其中，符合慢性移植腎失功的病例有28例，其中男21例(45±10歲)，女7例(42±9歲)，患者為行同種異體腎移植術(shù)后1～9年而出現(xiàn)移植

8、腎功能減退者，平均腎移植時(shí)間為3.5年，28例患者中18例是接受CsA+MMF+Pred三聯(lián)免疫抑制治療方案，9例接受FK506+MMF+Pred方案治療，1例接受西羅莫司+嗎替麥考酚酯+潑尼松三聯(lián)免疫抑制治療方案。腎穿前通過(guò)彩超和血清藥物濃度(FK506、CsA)檢測(cè)，并根據(jù)病理結(jié)果，排除急性排斥反應(yīng)、免疫抑制藥物腎毒性損傷、梗阻/返流、腎動(dòng)脈或靜脈血栓或栓塞、及其他疾病。供、受者血型相同，淋巴細(xì)胞毒交叉配型試驗(yàn)(CDC)＜10％，群

9、體反應(yīng)性抗體(PRA)＜10％，HLAA、B、Dr位點(diǎn)至少有二個(gè)位點(diǎn)相配。以5例正常腎組織作為對(duì)照組(Normal組)，均為正常供體尸腎術(shù)前穿刺活檢標(biāo)本，病理檢查無(wú)異常。33例標(biāo)本均制成蠟塊，同時(shí)進(jìn)行HE染色，PASM染色和Masson三色染色，同時(shí)行IgG、IgA、IgM、Clq和C4c免疫組化檢測(cè)，光鏡下觀察移植腎病理改變。
　　 病理分級(jí):
　　 同時(shí)對(duì)移植腎組織標(biāo)本按照最新的Banff2007移植腎病理分類標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)

10、行病理診斷及分級(jí)，將病理診斷為慢性移植腎失功，按炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度分為:腎小管間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況分為輕度、中度和重度。輕度:少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，呈散在分布(＜25％);中度:片狀或灶性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(26％～50％);重度:大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(＞50％)。
　　 而無(wú)其他特殊病因的間質(zhì)纖維化或小管萎縮分為:Ⅰ級(jí)輕度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(＜25％的皮質(zhì)受累);Ⅱ級(jí)中度間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮(26％～50％的皮質(zhì)受累);Ⅲ級(jí)重度間質(zhì)纖維

11、化和腎小管萎縮(＞50％的皮質(zhì)受累)，可能包括非特異的血管和腎小球硬化但伴有重度小管間質(zhì)病變。
　　 圖像分析處理:
　　 所有標(biāo)本均采用免疫組織化學(xué)ELiVisionTMplus二步法檢測(cè)腎組織中GSK-3beta的表達(dá)，圖像分析方法采用LeicaQwin高清晰度彩色病理圖像分析系統(tǒng)(型號(hào)DMR+Q550)，通過(guò)光學(xué)顯微鏡放大400倍攝取并分析圖像。每例標(biāo)本連續(xù)選取10個(gè)不重疊(避開(kāi)腎小球和大血管)的腎小管間質(zhì)高倍視野

12、(×400，HPF)，觀察部位包括腎皮質(zhì)、皮髓交接處和髓質(zhì)部的腎小管間質(zhì)，每例腎小管總數(shù)大于60個(gè)，以細(xì)胞染成黃色為陽(yáng)性，使用IPP(ImagePro-Plus)軟件測(cè)定累積光密度(IOD)和平均面積，IOD值越大提示免疫反應(yīng)越強(qiáng);測(cè)定視野中腎小管間質(zhì)陽(yáng)性表達(dá)面積與視野內(nèi)腎小管間質(zhì)總面積(去除腎小管管腔)的比值，取其均值代表此例患者某種成分在腎小管間質(zhì)的相對(duì)含量。
　　 統(tǒng)計(jì)分析:
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法，采用SPSS13

13、.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，GSK-3beta的表達(dá)量進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)(Levene檢驗(yàn))后，方差齊性者采用單因方差分析(one-wayANOVA)比較各指標(biāo)的組間差異，并采用LSD法進(jìn)行兩組間的多重比較;方差不齊者則采用F檢驗(yàn)Welch法進(jìn)行比較，并采用Dunnett'T3法進(jìn)行兩組間的多重比較，雙變量相關(guān)性采用(Spearman相關(guān)系數(shù))等級(jí)相關(guān)分析，取雙側(cè)，檢驗(yàn)水平α=0.05，P≤0.05被認(rèn)為有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　

14、 結(jié)果:
　　 1.慢性移植腎失功移植腎病理組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為:間質(zhì)纖維化和小管萎縮伴炎癥細(xì)胞(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)浸潤(rùn)，部分小管擴(kuò)張;腎小球基底膜增厚，呈雙軌征改變部分小球呈節(jié)段性硬化，腎小球系膜區(qū)增寬，部分系膜溶解;腎小管周?chē)?xì)血管基底膜增厚;動(dòng)脈內(nèi)膜增厚。不符合急性排斥反應(yīng)、免疫抑制藥物腎毒性損傷、梗阻/返流、等其他疾病病理改變。
　　 2.腎小管間質(zhì)GSK-3β的表達(dá)通過(guò)免疫組織化學(xué)染色顯示，在正常腎臟組織，

15、無(wú)或僅有極少量GSK-3β表達(dá)，GSK-3β主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞胞漿中，多呈弱陽(yáng)性表達(dá);而在慢性移植腎失功移植腎組織中GSK-3β主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞胞漿中較正常腎組織明顯增強(qiáng)，并隨腎組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化、小管萎縮程度而遞增(見(jiàn)表1、表2、圖1、圖2)。
　　 3、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，GSK-3β在慢性移植腎失功組腎小管、間質(zhì)的表達(dá)比正常腎組織明顯增多，兩者間差異均有顯著性(P值均＜0.001)，GSK

16、-3β的表達(dá)(面積百分比(％)和IOD)隨慢性移植腎失功炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度和IF/TA病理分級(jí)的加重而呈增加的趨勢(shì)(分別為F=11.050，P=0.000和F=11.518，P=0.000及F=7.492，P=0.001和F=7.978，P=0.000)，但GSK-3β(％)在移植腎IF/TAⅡ級(jí)和Ⅲ級(jí)組間表達(dá)量差異不顯著(P＞0.05)，GSK-3β(IOD)在移植腎IF/TAⅠ級(jí)和IF/TAⅡ級(jí)組間及IF/TAⅡ級(jí)和Ⅲ級(jí)組間表達(dá)量差異

17、均不顯著(P＞0.05);經(jīng)等級(jí)相關(guān)分析，通過(guò)Image-Pro軟件分析，慢性移植腎失功患者移植腎組織中GSK-3β的IOD(累積光密度)值明顯高于正常腎組織，并與炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和間質(zhì)纖維化/小管萎縮呈正相關(guān)(r=0.688和0.584，p＜0.05)。其值越大，提示小管間質(zhì)病變?cè)街?圖3，4)。
　　 結(jié)論:
　　 1、慢性移植腎失功移植腎病理組織學(xué)改變主要表現(xiàn)為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、腎間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮。
　　 2