1、　　本文針對MDV-1RBIB株UL49基因序列(編碼被膜蛋白VP22)尋找siRNA靶序列，根據(jù)siRNA陰性對照設計原則設計相應的陰性對照。經(jīng)BLAST驗證，所選擇的靶序列與雞體和其他病毒基因片段無同源性。在設計的靶序列5'端開始的19個核苷酸為正義鏈，中間加入9個核苷酸TTCAAGAGA的間隔以形成發(fā)夾結構，3'端加有轉錄終止信號TTTTTT。并且5'端帶有BamHⅠ(GATCC)酶切位點，3'端帶有SalⅠ(GTCGAC)和Hi

2、ndⅢ(TTCGA)酶切位點。靶序列分別被克隆到psilence2.0-U6載體上。經(jīng)SalⅠ酶切鑒定和測序鑒定后，證明已成功地構建了針對UL49基因不同區(qū)域的shRNA(smallhairpinRNA)表達載體。同時根據(jù)Ambion公司已發(fā)表的針對加強綠色熒光蛋白(EGFP)的siRNA序列構建了相應的陽性對照載體pu6EGFP。　　以提取的MDV-1RBIB株病毒基因組DNA為模板，根據(jù)GeneBank上發(fā)表的MDVMd5株UL4

3、9基因序列設計1對特異性引物，擴增出UL49(750bp)基因，克隆到pMD18-TSimpleVector。目的片段經(jīng)雙酶切連接到pEGFPC1載體上，構建了pEGFP-vp22融合表達載體。經(jīng)轉染CEF細胞，分別在24h，48h，72h觀察熒光的變化。PEGFP-vp22與構建的針對UL49基因不同區(qū)域的shRNA表達載體分別兩兩共轉染CEF細胞后，分別在24h，48h，72h觀察熒光的變化。在此基礎上以內標法進行相對定量RT-PC

4、R(反轉錄聚合酶鏈反應)，在mRNA水平上來驗證這些shRNA表達載體的有效性?！　∵x取能有效抑制MDV1型超強毒RB1B株的被膜蛋白VP22的shRNA表達載體—pu6vp22-4，通過轉染CEF細胞后，再接種超強毒RB1B株，通過蝕斑數(shù)的比較來驗證RNA干擾(RNAinterference，RNAi)能否有效抑制MDV蝕斑的形成。在此基礎上進一步觀察pu6vp22-4抑制MDV蝕斑的形成的動態(tài)效應、劑量效應、以及CEF細胞感染MD