1、馬立克氏病病毒(Marek's disease virus，MDV)依據基因組結構分類屬于皰疹病毒科，α皰疹病毒亞科。MDV分為三種血清型：致瘤性血清Ⅰ型(MDV-1)、非致瘤性血清Ⅱ型(MDV-2)和非致病性血清Ⅲ型(MDV-3)或稱火雞皰疹病毒(herpesvirus of turkeys，HVT)。MDV-1是禽類馬立克氏病(Marek's disease，MD)的病原體，其毒力由低至高依次為溫和型(m)、毒力型(v)、超強毒力型

2、(vv)和特超強毒力型(vv+)。MD是致死性的淋巴系統(tǒng)增生性疾病并伴隨神經系統(tǒng)病變。神經系統(tǒng)病變以早期短暫麻痹(TP)、持續(xù)性神經損傷和晚期麻痹等為特征。MDV感染后可引起強烈的細胞因子反應。細胞因子應答在介導細胞免疫反應以及對抗病毒感染過程中起重要作用。MDV可感染中樞神經系統(tǒng)(CNS)并引起不同類型的病理反應。MDV感染后的細胞因子反應在腦組織局部天然免疫反應和免疫病理反應過程中均發(fā)揮重要作用。本次實驗首先以雞大腦中的小膠質細胞為

3、研究對象，研究并評價小膠質細胞在vvMDV毒株YL040920和弱毒疫苗株CVI988/Rispens體外感染后的促炎癥反應效應。Toll樣受體家族(toll-likereceptors，TLRs)識別病毒是誘導促炎癥反應發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)。研究發(fā)現，很多病毒和病毒配體可活化TLR2信號并伴隨促炎癥反應發(fā)生。但對于雞TLRs在MDV誘導促炎癥反應發(fā)生中的作用還不明確。TLR15屬于TLR1家族成員并具有禽類特異性。然而，對于TLR15與病毒

4、感染的關系還無研究。因此，本次實驗進一步研究TLR2和TLR15信號在MDV感染后促炎癥反應發(fā)生中的作用。研究內容和結果如下：
　　 1、雛雞大腦神經膠質細胞培養(yǎng)及小膠質細胞純化鑒定。從雛雞大腦皮質得到混合神經膠質細胞培養(yǎng)物。然后通過“振蕩-吸附”分離和“吸附-富集”等程序純化得到小膠質細胞。通過細胞化學染色法檢測表達非特異性酯酶的小膠質細胞并確定細胞的純度。通過雙重的“分離-富集”程序，可得到純化的小膠質細胞單層培養(yǎng)物，其純度

5、>95%。
　　 2、vvMDV毒株YL040920和弱毒疫苗株CVI988/Rispens病毒體外感染小膠質細胞。純化的小膠質細胞單層分別感染YL040920和CVI988/Rispens病毒。YL040920和CVI988/Rispens活病毒在體外感染小膠質細胞3d后逐漸產生以多處細胞脫落為特征的細胞病變效應(CPE)。使用MDV MEQ的特異性mAb，通過免疫組織化學法檢測到病毒感染3d后小膠質細胞核內MEQ蛋白的表達。

6、通過檢測MDV meq基因DNA的復制和gB基因mRNA的轉錄，證明了病毒DNA和特定基因可在小膠質細胞復制和轉錄。YL040920和CVI988/Rispens病毒感染后meq DNA和gB mRNA均可在小膠質細胞復制和轉錄，但CVI988/Rispens感染的小膠質細胞的病毒載量和gB mRNA轉錄水平均顯著高于相同數量的YL040920感染的小膠質細胞(P≤0.05/0.01/0.001)。
　　 3、MDV-1可感染雞

7、大腦小膠質細胞并促進其Toll樣受體15和1LB基因的轉錄。分別用YL040920和CVI988/Rispens感染純化的小膠質細胞用qRT-PCR法檢測MDV-1感染對小膠質細胞Toll樣受體家族基因轉錄的影響。結果發(fā)現，MDV-1的感染可上調小膠質細胞TLR15和TLR1LB基因的轉錄水平。小膠質細胞中TLR15和TLR1LB mRNA的轉錄水平在YL040920感染1d后升高，于3 dpi達到最高值，到5 dpi時有所降低。檢測到

8、小膠質細胞中TLR1LB mRNA轉錄水平在CVI988/Rispens感染1d后升高，到3 dpi時達最高值，而TLR15 mRNA的轉錄水平在3 dpi后開始升高，二者在5 dpi時均降低。比較YL040920和CVI988/Rispens對TLRs mRNA轉錄的影響發(fā)現vvMDV毒株YL040920感染小膠質細胞后主要促進其TLR15基因的轉錄(P≤0.01/0.001)，而弱毒疫苗株CVI988/Rispens感染后則主要促進

9、TLRILB基因的轉錄(P≤0.001)。
　　 4、MDV-1感染雛雞小膠質細胞后細胞因子和iNOS的表達模式。用YL040920或CVI988毒株的活病毒感染純化的雛雞小膠質細胞。結果發(fā)現，盡管YL040920感染小膠質細胞后病毒載量低于CVI988感染后的病毒載量，但二者促進IFN-γ和IL-12p35 mRNA轉錄水平增加的程度無顯著性差異(P>0.05)。與CVI988相比，YL040920活病毒或固定病毒刺激小膠質細

10、胞后IL-12p40、IL-8和MIP-1β基因的轉錄顯著增加(P≤0.01/0.001)。CVI988(尤其是活病毒)可顯著促進小膠質細胞IFN-β mRNA轉錄，而YL040920促進IFN-β mRNA轉錄的作用較弱(P≤0.05/0.001)。iNOS基因的轉錄和NO表達均與YL040920和CVI988感染的水平有關。固定的MDV(尤其是CVI988毒株)具有更強的促進iNOS/NO表達的活性(P≤0.05/0.01/0.00

11、1)。研究認為，小膠質細胞是MDV感染后IL-12p40、IL-12p35、IFN-γ、IFN-β、IL-8、MIP-1β、iNOS mRNA和NO等的重要來源。IL-12p35和IFN-γ基因的轉錄與病毒DNA的復制密切相關；而IL-12p40、IFN-β、IL-8和MIP-1β的轉錄水平與病毒DNA的復制和病毒特定基因的表達均相關。iNOS mRNA的轉錄依賴于病毒特定基因的表達，但受病毒復制的抑制。盡管YL040920和CVI98

12、8感染小膠質細胞后Th1類細胞因子IFN-γ轉錄增加的程度并無差異，但YL040920誘導了強烈的IL-12(p40和12p35)、IL-8和MIP-1β反應。
　　 5、HVT感染抑制TLR1/2復合體介導的NF-κB活化。用HVT FC-126毒株感染Vero細胞單層。HVT感染后的Vero細胞表現為細胞圓縮，隨后病變細胞簇迅速發(fā)展為呈針狀放射排列。用qPCR檢測到病毒感染后Vero細胞內HVT SORF1基因的復制。將pV

13、ITRO1-chTLR1LA(1-1)、chTLR1LB(1-2)、chTLR2A(2-1)、chTLR2B(2-2)重組表達質粒和pNiFty2-SEAP用LipofectamineTM2000(Invitrogen)共轉染Vero細胞，使其在Vero細胞表達。HVT感染可以顯著抑制單獨或共轉染了chTLR1-1和chTLR1-2的Vero細胞內NF-κB的基礎活性(P≤0.01/0.001)。Zymosan可顯著促進chTLR1和c

14、hTLR2共轉染的Vero細胞內的NF-κB活性，HVT感染后還可以顯著抑制由Zymosan誘導的NF-κB活化(P≤0.05/0.01)。實驗結果顯示，chTLR1s(1LA或1LB)參與HVT感染后TLR1/2信號途徑的抑制環(huán)節(jié)。
　　 6、MDV-1感染后通過TLR1/2復合體和TLR15活化NF-κB。實驗通過RNAi的方式分別抑制TLR1LA、TLR1LB、TLR2A、TLR2B和TLR15在DF-1細胞的表達。結果發(fā)

15、現，TLR1/2復合體和TLR15在MDV-1感染后NF-κB活化過程中均起作用(P≤0.01/0.001)，但前者的作用明顯強于后者(P≤0.01/0.001)。在TLR1/2復合體中，TLR2B起相對重要的作用(P≤0.05)，而TLR1LA和TLR1LB之間未發(fā)現作用的差異(P>0.05)。與感染弱毒疫苗株CVI988病毒相比，TLR15在vvMDV毒株YL040920感染后NF-κB活化過程中的作用相對明顯(P<0.05)。

16、r>　　 概括而言，本課題研究發(fā)現MDV-1(包括vvMDV和弱毒疫苗株CVI988)均可感染雞大腦小膠質細，并分別促進TLR15和TLR1LB基因轉錄。vvMDV感染小膠質細胞后可誘導強烈的IL-12、IL-8和MIP-1β等促炎癥反應，它們可能誘導MDV感染后腦組織局部Th1反應。MDV-1感染后主要通過與TLR1/2復合體相互作用，活化NF-κB，誘導促炎癥反應。TLR15在MDV-1(尤其是vvMDV)感染后促炎癥反應信號活化