1、目的：
　　吸煙是引起慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD）的主要原因。氣道重塑是COPD不可逆性氣流受限的主要原因。一般認(rèn)為，COPD氣道重塑的機制與炎癥細胞活化、氧化抗氧化失衡、蛋白酶抗蛋白酶失衡、細胞凋亡等有關(guān)。最近，越來越多的研究表明上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（epithelial mesenchymal transdifferentiation,EMT）參與了氣道重塑

2、的發(fā)生。氣道上皮作為抵御外來損傷因素的第一道防線，吸入的煙草煙霧進入人體最先直接接觸人體的氣道。尼古丁是香煙煙霧中的主要有害成分。尼古丁對氣道上皮的直接影響目前還不清楚。本研究首次采用基因芯片技術(shù)和雙向凝膠電泳技術(shù)觀察尼古丁刺激人氣道上皮細胞后差異基因和蛋白的表達情況，為進一步闡明氣道重塑機制提供線索。
　　方法：
　　一、體外培養(yǎng)原代人小氣道上皮細胞，待原代人氣道上皮細胞生長至80％融合時，換用無生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)2

3、4小時，使細胞同步于靜止期。將細胞隨機分成兩組，每組再分成兩個平行組，即尼古丁刺激4小時組和空白對照組，尼古丁刺激48小時組和空白對照組。實驗組加入尼古?。?310-5M），對照組加入PBS，分別孵育4小時和48小時后吸走，加入Trizol試劑，收集細胞用于基因芯片檢測。
　　二、根據(jù)基因芯片結(jié)果，選取部分表達差異基因用熒光定量PCR方法進行驗證。
　　三、體外培養(yǎng)人支氣管上皮細胞16HBE,待16HBE細胞生長至80%融合

4、時，換含1%的胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時，使細胞同步于靜止期。采用隨機化的原則進行分組：（1）對照組，加入PBS；（2）實驗組，加入尼古?。ńK濃度1310-5M），孵育72小時后加入裂解液收集細胞用于雙向凝膠電泳。通過雙向凝膠電泳實驗分離總蛋白，差異表達蛋白質(zhì)點應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜獲取肽質(zhì)量指紋圖譜并通過 NCBI數(shù)據(jù)庫鑒定。
　　結(jié)果：
　　一、基因芯片結(jié)果
　　（1）尼古丁處理4h后，表達

5、上調(diào)的基因有63個，表達下調(diào)的基因有44個，主要涉及細胞對外界刺激的應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)基因。
　?。?）尼古丁處理48h后，表達上調(diào)的基因有860個，表達下調(diào)的基因有582個。對差異基因進行Gene GO分析和Pathway分析，發(fā)現(xiàn)差異基因涉及到胚胎發(fā)育、細胞極性維持、細胞與細胞黏附等與細胞轉(zhuǎn)分化相關(guān)的重要生理過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
　?。?）進一步對個別基因進行分析，發(fā)現(xiàn)尼古丁可以下調(diào)上皮角蛋白（CK）、上皮黏蛋白（MUC）等具

6、有上皮特征的基因；上調(diào)纖維連接蛋白1（FN1）、N鈣粘蛋白（N-cadherin）等具有間質(zhì)細胞特征的基因。
　　二、熒光定量PCR結(jié)果熒光定量PCR驗證的基因差異表達與基因芯片結(jié)果變化趨勢一致。
　　三、雙向凝膠電泳結(jié)果
　　雙向凝膠電泳圖譜中找到23個表達量有明顯差異的蛋白質(zhì)點，質(zhì)譜鑒定出19種蛋白質(zhì)。其中與細胞骨架相關(guān)的蛋白明顯下調(diào)，如微管蛋白、γ1-肌動蛋白等。
　　結(jié)論：
　　不論從基因組水平還是