1、肝臟移植作為目前治療終末期肝病的有效手段之一已經(jīng)得到共識(shí)，但是排斥反應(yīng)的發(fā)生一直是對(duì)移植肝功能能否長久維持的一個(gè)重要原因。因此免疫排斥一直是研究的熱點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)擬在大鼠同種異體肝移植模型基礎(chǔ)上，通過聯(lián)合阻斷CD28/B7和ICOS，探討肝移植中排斥反應(yīng)的機(jī)制，以及CTLA－4Ig，ICOS－Ig對(duì)移植肝功能的影響，能否阻斷或減輕排斥反應(yīng)，提高受體存活時(shí)間。 材料與方法 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：供體采用SD大鼠，受體選用Wistar大鼠，

2、供受體均為雄性，體重150～200g，由中國醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供。 實(shí)驗(yàn)一：大鼠肝移植模型的制備：在Kamada二袖套法的基礎(chǔ)上并做改進(jìn)，成功建立了穩(wěn)定的大鼠肝移植模型。 實(shí)驗(yàn)二：根據(jù)是否給予ICOS—Ig以及應(yīng)用劑量的多少，分成4組，每組10只： 對(duì)照組：僅進(jìn)行肝臟移植；實(shí)驗(yàn)1組：分別于肝臟移植術(shù)后第1、3、5天，腹腔內(nèi)注射ICOS－Ig100μg/Kg；實(shí)驗(yàn)2組：分別于肝臟移植術(shù)后第1、3、5天，腹腔內(nèi)注射I

3、COS—Ig200μg/Kg；實(shí)驗(yàn)3組：分別于肝臟移植術(shù)后第1、3、5天，腹腔內(nèi)注射ICOS—Ig300μg/Kg。肝移植術(shù)后第1，3，5，7天取血檢測血清ALT，TBIL；術(shù)后第7天切取移植肝臟HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化；免疫組化法觀察ICAM-1表達(dá)情況；半定量Rt－PCR法檢測肝組織IL－10，IL－2，ICOS基因表達(dá)水平；另外明確ICOS－Ig的最佳應(yīng)用劑量。 實(shí)驗(yàn)三：隨機(jī)分成3組，每組10只；ICOS－Ig組：分別于

4、肝移植術(shù)后第1、3、5天，腹腔內(nèi)注射ICOS—Ig200μg/KG；CTLA4Ig組：分別于肝移植術(shù)后第1、3、5天，腹腔內(nèi)注射CTLA4Igl50μg/Kg；聯(lián)合阻斷組：分別于肝臟移植術(shù)后第1、3、5天，腹腔內(nèi)注射CTLA4-Igl50μg/Kg及ICOS—Ig200μg/Kg。肝移植術(shù)后第1，3，5，7，14，21，28天取尾靜脈血測血清ALT，TBIL；術(shù)后第28天切取受者肝臟HE染色觀察組織形態(tài)學(xué)變化；免疫組化法觀察移植肝IC

5、AM—l表達(dá)情況。半定量RT—PCR法檢測肝組織IL-10，IL-2基因表達(dá)水平。 所用數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采取t檢驗(yàn)。P

6、min。無肝期10-16min。術(shù)后一般3-9d出現(xiàn)急性排斥反應(yīng)，不用免疫抑制劑9d左右死于排斥反應(yīng)所致的肝功能衰竭。 實(shí)驗(yàn)二：對(duì)照組移植后第1天血清轉(zhuǎn)氨酶很快升高，1周內(nèi)發(fā)生排斥，受體大鼠存活時(shí)間7.00±0.39d。實(shí)驗(yàn)1組受體大鼠于移植后第3天血清轉(zhuǎn)氨酶下降，但在第6-12天發(fā)生排斥，受體大鼠平均存活時(shí)間為15.00±2.74d。而實(shí)驗(yàn)2組于移植后第3天血清轉(zhuǎn)氨酶明顯下降，血清轉(zhuǎn)氨酶維持正常水平的時(shí)間較前兩組明顯延長，受體

7、大鼠平均存活時(shí)間為29.00±0.00d。實(shí)驗(yàn)3組肝移植后血清轉(zhuǎn)氨酶變化規(guī)律與實(shí)驗(yàn)2組相同，受體大鼠平均存活時(shí)間為28.00±0.00d。實(shí)驗(yàn)2、3組和前兩組比較，受體大鼠存活時(shí)間有顯著性差異(P<0.05)；而實(shí)驗(yàn)2組和3組比較，受體大鼠存活時(shí)間無明顯差別(P>O.05)。實(shí)驗(yàn)1組和對(duì)照組比較，受體大鼠存活時(shí)間有顯著性差異(P<0.05)o肝移植術(shù)后第7天移植物內(nèi)IL-2mRNA在實(shí)驗(yàn)2.3組呈現(xiàn)呈低表達(dá)，而在對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)1組呈現(xiàn)高表

8、達(dá)；IL-10mRNA呈高表達(dá)尤以實(shí)驗(yàn)2，3組為明顯，在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)1組呈低表達(dá)。ICAM—l在對(duì)照組發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)高表達(dá)o ICOS-Ig00μg/Kg為最佳劑量o 實(shí)驗(yàn)三：血清轉(zhuǎn)氨酶變化：CTLA4Ig組，ICOS—Ig組受體大鼠均于移植后第3天接近正常。聯(lián)合阻斷組肝移植后血清轉(zhuǎn)氨酶變化規(guī)律與前2組相似；總膽汁酸變化：CTLA4Ig組，ICOS-Ig組均于術(shù)后一周左右正常，但聯(lián)合阻斷組于術(shù)后第5天左右降至正常。聯(lián)合阻斷組

9、ALTTBIL變化較前兩組更明顯且受體大鼠平均存活時(shí)間較前兩組明顯延長，為37.00±2.19d，存在顯著差異(P<0.05)；而CTLA4Ig組和ICOS-Ig組比較，存活時(shí)間無明顯差別(P>0.05)。對(duì)肝臟IL-10mRNA進(jìn)行半定量RT-PCR分析可見，IL-10表達(dá)在聯(lián)合阻斷組明顯處于高水平。IL-2在對(duì)照組表達(dá)為高水平，而其他三組均呈低表達(dá)，尤其以聯(lián)合阻斷組為明顯。 1．大鼠肝移植模型的制備依據(jù)改進(jìn)的“Kamada二

10、袖套法”，效果良好，成功率在94％。 2．ICOS在大鼠同種異體肝移植發(fā)生排斥反應(yīng)時(shí)表達(dá)上訶，ICOS-Ig可以通過阻斷ICOS共刺激信號(hào)途徑，誘導(dǎo)大鼠同種異體肝移植發(fā)生免疫耐受，減輕排斥反應(yīng)，延長受體大鼠存活時(shí)間。大鼠ICOS-Ig抗排斥反應(yīng)的最佳用藥劑量為200ug/Kg。 3．聯(lián)合阻斷CD28/B7和ICOS，可明顯抑制移植排斥反應(yīng)，延長大鼠存活時(shí)間。 4．ICAM-1在移植肝發(fā)生急性排斥時(shí)高表達(dá)，隨著排