1、背景：
　　乳腺癌的發(fā)生發(fā)展可分為多個層次多個步驟，轉移是其中的關鍵環(huán)節(jié)，常常導致病人的高死亡率。由于轉移過程比較復雜，我們需要從基礎和臨床兩方面入手，深入揭示乳腺癌細胞轉移的分子機制，以利于獲取腫瘤發(fā)生的早期預警信號，及時的進行診斷和干預，最終提高患者的治療效果和生活質量，緩解、減輕社會和個人的負擔。腫瘤轉移過程非常復雜，通常涉及到許多轉移相關分子，而對單個分子的干預可能達不到所希望的成效。因為miRNA可以同時靶向多個腫瘤轉移

2、相關分子，使上述難題得以部分解決。近年來，miRNA與腫瘤轉移關系的研究漸成為醫(yī)學熱點，其中關于miRNA與乳腺癌細胞轉移關系的研究尤為火熱，但目前進展還不盡如人意，許多問題尚待解決。除了已報道的腫瘤轉移抑制miRNA，是否有新的miRNA參與其中呢？若存在，這些新的miRNA分子下調了何種轉移相關分子（靶分子）？靶分子（早已報道的或最近發(fā)現的）參與乳腺癌細胞轉移的具體機制是什么？新miRNA分子逆轉腫瘤表型的能力是否可以在基礎與臨床研

3、究中得到一致性的證據呢？種種問題的提出和最終解決，必將為乳腺癌患者的治療帶來新的希望。
　　目的：
　　尋找并鑒定參與乳腺癌細胞轉移的新miRNA分子，初步探討新miRNA分子以何種途徑來影響乳腺癌細胞的轉移，這種作用結果是否可以在基礎功能研究和臨床觀察、檢測中獲得統(tǒng)一的認識，最終為乳腺癌的早期預警、分子診斷和治療提供一定的理論依據。
　　方法：
　　1．依據GEO profiles軟件查詢并分析NFAT5在乳腺

4、癌細胞轉移相關的芯片數據中的表達情況。qRT-PCR和WB方法檢測NFAT5在乳腺癌細胞系中的表達，篩選得到高表達和低表達 NFAT5的細胞系。siNFAT5 mimics轉染或者pLKO.1-GFP-shNFAT5穩(wěn)定感染MDA-MB-231細胞系后，劃痕實驗、遷移侵襲實驗、尾靜脈注射裸小鼠內臟轉移實驗觀察細胞的遷移和侵襲能力。裸鼠成瘤實驗觀察乳腺癌細胞的體內生長和增值狀況。
　　2．芯片結果結合生物信息學預測得知，NFAT5可

5、能受到miR-568的調控。利用雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)驗證預測結果。qRT-PCR方法檢測miR-568在乳腺癌細胞系及臨床組織標本中的表達。將miR-568 mimics、antagomiR-568 mimics分別轉染MDA-MB-231、MCF-7細胞后，檢測NFAT5的表達并且觀察目的細胞侵襲能力的變化。將穩(wěn)定感染pGCsil-miR-568的MDA-MB-231細胞接種于裸鼠右側后肢背部的皮下或尾靜脈注射裸小鼠，觀察其原位成瘤

6、及肺轉移情況。
　　3．qRT-PCR及WB方法檢測S100A4在乳腺癌細胞系中的表達，ChIP實驗驗證NFAT5與S100A4啟動子的結合情況。將不同濃度的 siNFAT5 mimics轉染MDA-MB-231細胞后，檢測 S100A4 mRNA及其蛋白質的表達變化。在MDA-MB-231、MCF-7細胞中分別轉染miR-568 mimics或antagomiR-568 mimics后，qRT-PCR檢測S100A4 mRNA的

7、表達變化。在MDA-MB-231細胞中轉染siNFAT5或者siS100A4后，qRT-PCR、WB及間接免疫熒光實驗檢測EMT相關分子的表達（主要為E-cadherin和Vimentin）。免疫組織化學實驗檢測不同級別乳腺癌組織中NFAT5、S100A4、E-cadherin及Vimentin的表達，并分析其相關性。siNFAT5、siS100A4或miR-568 mimics轉染MDA-MB-231細胞后，qRT-PCR檢測CD44

8、、RhoA、MMP2和MMP9的表達，流式細胞術檢測細胞周期分布，WB檢測ERK、Akt及其磷酸化的表達水平。
　　4．qRT-PCR及ELISA實驗檢測乳腺癌細胞系及臨床送檢血液中VEGF-C的表達水平，分析其與乳腺癌轉移的相關性。ChIP實驗驗證NFAT5與VEGF-C啟動子的結合情況。將miR-568或siNFAT5 mimics轉染MDA-MB-231細胞后，qRT-PCR及ELISA實驗檢測VEGF-C的表達
　　

9、5．qRT-PCR檢測乳腺癌細胞系和乳腺癌患者組織中Hotair的表達。下調或過表達Hotair后，觀察乳腺癌細胞侵襲能力的變化。單獨或聯合下調Hotair、SUZ12或者EZH2后，qRT-PCR檢測miR-568的表達變化。
　　結果：
　　1．依據GEO profiles軟件查詢并分析已發(fā)表的乳腺癌細胞轉移相關的芯片數據可知，NFAT5在轉移能力較強的乳腺癌細胞中的表達較高。經篩選得到了高表達和低表達NFAT5的乳腺癌

10、細胞系MDA-MB-231和MCF-7。干涉NFAT5的表達后，MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力下降。NFAT5表達的下調抑制乳腺癌細胞的原位成瘤及肺臟轉移，體內外實驗結果一致表明，NFAT5能夠促進乳腺癌細胞的轉移。
　　2．與芯片結果和生物信息學預測相吻合，雙熒光素酶報告基因結果顯示miR-568可以靶向抑制NFAT5的表達，實時定量PCR結果顯示在乳腺癌細胞系及臨床乳腺癌組織樣本中miR-568與NFAT5的表達呈負

11、相關。miR-568表達上調或下調試驗結果表明，乳腺癌細胞的侵襲和轉移能力隨之下降或上升，同時檢測NFAT5的表達變化。體內實驗觀察到miR-568可以部分抑制乳腺癌細胞的生長，但顯著降低其肺臟轉移能力。綜上所述，miR-568通過下調NFAT5的表達抑制乳腺癌細胞的轉移。
　　3．S100A4與NFAT5在乳腺癌細胞系中的表達趨勢基本相符。ChIP實驗結果表明，NFAT5可以結合到S100A4的啟動子區(qū)上，并正向調控其基因表達，

12、MDA-MB-231細胞轉染siNFAT5或siS100A4后，qRT-PCR、WB及間接免疫熒光試驗結果表明，NFAT5通過上調S100A4來調控EMT相關分子E-cadherin，Vimentin等的表達。臨床乳腺癌組織標本的免疫組化結果提示，NFAT5、S100A4的表達與E-cadherin呈負相關，與Vimentin呈正相關，并且其與臨床腫瘤TNM分級有良好的一致性。miR-568、siNFAT5或siS100A4轉染MDA-

13、MB-231細胞后，腫瘤轉移相關分子CD44、RhoA、MMP2、MMP9等的表達均被下調，ERK及Akt的磷酸化程度降低，腫瘤細胞的抗脫落凋亡效應下降。miR-568通過下調NFAT5間接抑制S100A4的表達，最終抑制乳腺癌細胞的轉移。
　　4．qRT-PCR及ELISA試驗結果表明，在高侵襲力的乳腺癌細胞系中VEGF-C的表達相對較高。與技術縮胸或良性乳腺疾病患者相比，淋巴結或肺轉移乳腺癌患者的送檢血液樣本中VEGF-C的濃

14、度變化有顯著的統(tǒng)計學差異。與S100A4的情形相同，VEGF-C受到NFAT5的正向轉錄調控，qRT-PCR及 ELISA實驗證實MDA-MB-231細胞轉染miR-568或siNFAT5 mimics后，VEGF-C的表達與分泌受到抑制。miR-568通過下調NFAT5間接抑制VEGF-C的表達，從而起到抑癌基因的作用。
　　5．qRT-PCR檢測Hotair在乳腺癌細胞系、乳腺癌及其匹配癌旁組織中的表達情況，Hotair的表達

15、與腫瘤細胞轉移能力呈正相關。以不同組合方式干涉Hotair、SUZ12或EZH2均可上調miR-568的表達，已知LincRNA Hotair可以表觀沉默基因的表達，據推測Hotair有可能通過表觀遺傳沉默的方式下調miR-568的表達來促進乳腺癌細胞的轉移。
　　結論：
　　1.體內外實驗證實了NFAT5可以促進乳腺癌細胞的轉移，其可以作為一個潛在的有效的治療靶點。
　　2. miR-568在乳腺癌細胞中的表達較低，

16、其可以通過下調NFAT5的表達抑制乳腺癌細胞的轉移。
　　3. NFAT5通過上調S100A4的表達來間接誘導EMT和促存活信號的發(fā)生，過表達miR-568或干涉掉NFAT5可逆轉上述表型。臨床樣本的免疫組化數據與上述基礎功能的研究結果體現出良好的一致性。miR-568通過下調NFAT5間接抑制S100A4的表達，最終表現為乳腺癌細胞的轉移抑制。
　　4. NFAT5通過誘導VEGF-C的表達與分泌進而刺激淋巴管血管生成。過