1、目的:心肌梗死是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化血栓性疾病導(dǎo)致病人死亡的嚴(yán)重臨床急性事件之一，其早期診斷、監(jiān)控和治療仍是目前廣大臨床和基礎(chǔ)研究工作者的一項(xiàng)艱巨任務(wù)。本研究平臺(tái)曾報(bào)道了Sema4D參與動(dòng)脈粥樣硬化血小板活化和血栓形成過程，提示Sema4D可能也參與心肌梗死的病理生理過程。因此，本研究利用體內(nèi)和體外的實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)Sema4D在心肌梗死過程中的基礎(chǔ)與臨床機(jī)制進(jìn)行了較全面深入的研究，從而為心肌梗死的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)及臨床早期診斷指標(biāo)。

2、>　　方法:本文首先純化了Sema4D細(xì)胞外片段重組蛋白，利用Sema4D細(xì)胞外段單克隆抗體（＃3，＃4），建立了人血漿可溶性Sema4D水平的夾心ELISA檢測(cè)方法，并檢測(cè)了臨床心肌梗死病人外周血可溶性Sema4D水平。
　　為了研究Sema4D參與心肌梗死的機(jī)制，本文建立了改良的小鼠心肌缺血再灌注動(dòng)物模型。
　　為了觀察心肌梗死后心功能的變化，分別在兩組小鼠接受心肌缺血再灌注術(shù)前和術(shù)后28天進(jìn)行心臟超聲檢測(cè)，從而確定Se

3、ma4D基因敲除對(duì)心功能的影響。
　　在小鼠心肌缺血再灌注模型的基礎(chǔ)上，應(yīng)用免疫組化的方法檢測(cè)了兩組小鼠心臟內(nèi)部在缺血45分鐘和分別給予再灌注2分鐘，15分鐘，30分鐘及60分鐘后的微血管血栓形成情況。
　　為了檢測(cè)血液系統(tǒng)Sema4D對(duì)心肌缺血再灌注的影響，在上述處理?xiàng)l件下，對(duì)另外兩組小鼠分別進(jìn)行心臟穿刺抽血并應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩組小鼠心肌缺血再灌注后其血小板與白細(xì)胞間的相互作用情況及血小板Syk磷酸化情況。
　　本

4、文進(jìn)一步應(yīng)用Real-Time PCR方法明確Sema4D及其受體基因在小鼠心臟的表達(dá)情況，以探討Sema4D下游信號(hào)通路機(jī)制。
　　此外，我們對(duì)心肌缺血再灌注過程中的兩項(xiàng)重要指標(biāo)，即ROS生成和鈣離子含量進(jìn)行檢測(cè)。
　　結(jié)果:
　　1.夾心ELISA方法檢測(cè)正常人群與心肌梗塞病人血漿樣本后發(fā)現(xiàn)，心肌梗塞病人血漿中可溶性Sema4D的含量明顯增高（10.980±6.150ng/ml，n=87 vs.5.183±3.30

5、1 ng/ml，n=53，P＜0.0001)，提示Sema4D參與心肌梗死的病理生理過程。
　　2.為了研究Sema4D參與心肌梗死的機(jī)制，我們成功建立了改良的小鼠心肌缺血再灌注動(dòng)物模型。
　　3.兩組小鼠心肌缺血再灌注手術(shù)后心臟梗死的面積評(píng)估顯示，Sema4D基因敲除后可顯著降低小鼠心肌缺血再灌注后的梗死面積10.7％，n=7 vs.30.2％，n=9，P＜0.01)。
　　4.手術(shù)前及術(shù)后28天的超聲心動(dòng)檢查結(jié)果顯

6、示Sema4D基因敲除可改善心肌缺血再灌注所帶來的心臟功能改變。Sema4D-/-小鼠術(shù)后左心室收縮末期直徑(LVID，s，P＜0.05)及左心室舒張末期直徑(LVID，d，P＜0.05)均小于對(duì)照組;射血分?jǐn)?shù)(LVEF)高于對(duì)照組(P＜0.05);左室短軸縮短率(LVFS％)對(duì)照組(P＜0.05)。
　　5.免疫組化切片結(jié)果顯示Sema4D基因敲除可有效抑制小鼠心肌缺血再灌注后心臟微血管血栓形成并改善血管內(nèi)血栓的堵塞情況。

7、>　　6.流式結(jié)果顯示Sema4D基因敲除可降低小鼠心肌缺血再灌注后血小板與白細(xì)胞間的相互作用，結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　7.Real-Time PCR方法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Sema4D及其受體基因在小鼠心臟均有表達(dá)，為隨后的Sema4D下游信號(hào)通路機(jī)制研究提供了可靠依據(jù)。
　　8.兩組小鼠心臟勻漿后進(jìn)行試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Sema4D基因敲除可降低小鼠心肌缺血再灌注后心肌的ROS生成(P＜0.01)。
　　9.兩組

8、小鼠心臟勻漿后進(jìn)行試劑盒檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Sema4D基因敲除可降低小鼠心肌缺血再灌注后心肌的Ca2+含量(P＜0.05)。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)，Sema4D參與心肌梗死的病理生理過程。其機(jī)制可能為:1) Sema4D通過心肌非依賴途徑參與心肌缺血再灌注，具體表現(xiàn)為Sema4D基因敲除后小鼠心肌血栓形成減少，Syk磷酸化降低，血小板與白細(xì)胞間的相互作用減少;2) Sema4D可能通過心肌信號(hào)通路途徑參與心肌缺血再灌注，因本文已發(fā)現(xiàn)Sem